人参总皂苷对γ射线照射后大鼠肝P450酶调节作用研究

对照品，溶解于甲醇乙腈（1∶1）混合液，终浓度为200μg·L^-1，于4℃的冰箱中备用[7]。

2.1.3液质分析条件液相条件：流动相A（含0.1%甲酸和5mmol·L^-1甲酸铵的纯水），流动相B（含0.1%甲酸的乙腈）；柱温25℃；流速0.45mL·min^-1；洗脱时间4.5min，进样量10μL。

质谱条件：离子源为电喷雾离子源（ESI源），采用多级质谱反应（multiplereactionmonitoring，MRM）检测装置检测各个样品组。毛细管的电压和温度分别为+4000V和320℃。雾化电压控制在25Pa，气体流速控制在10L·min-1，其他质谱参数见表1。

2.2qPCR法测定辐射后大鼠CYP450酶mRNA的表达

2.2.1大鼠肝组织总RNA的提取将大鼠脱臼处死，用生理盐水冲洗肝脏，直至土黄色，剪取适量肝脏装于冻存管中，置于液氮中速冻，于-80℃长期保存。RNA的提取按照Biomed公司的组织RNA提取试剂盒操作。用酶标仪检测RNA的吸光度A²60/280在1.7～1.9，根据RNA浓度计算逆转录时RNA的上样量。

2.2.2逆转录（cDNA）根据试剂盒要求，RNA的上样量为1μg，依此求出上样体积。反应体系为2×TSReactionMix10μL，AnchoredOligo（dT）181μL，T_ransScriptRT/RIEnzymeMix1μL，RNA上样体积，用RNasefreeWater补足20μL，涡旋5s，离心80r·s^-1。设置反转录相关条件：42℃30min，85℃5min，4℃30s，得到的逆转录产物保存在-20℃。

2.2.3qPCR（实时定量qPCR反应）反应体系为20μL，包含10μL的2×T_ransStartGreenqPCRSuperMix，0.4μL的ForwardPrimer，0.4μL的ReversePrimer，0.4μL的PassiveRefereceDye，最后加6.8μL的ddH2O补足20μL。PCR的反应条件为94℃30s，94℃5s，60℃30s，循环数40个，内参选βactin基因。mRNA表达水平的定量分析用2-ΔΔ_Ct表示，级RQ值，Ct值为测定荧光域值得循环数[7]。实验结果至少重复3次以上。与实验相关的特性性引物序列见表2[7]。

2.3Westernblot法测定辐射后P450同工酶的蛋白表达量

2.3.1组织蛋白提取和蛋白变性肝组织蛋白提取按康为世纪公司的组织蛋白抽提试剂盒步骤操作。用BCA法测定蛋白含量，用2×Buffer缓冲液稀释至浓度为2μmol·L^-1，95℃变性20min。

2.3.2电泳、转膜、封闭和孵育相关条件上样量20μg；电泳条件：电泳电压控制在160V，电流90mA，功率15W，时间2h；转膜条件：电压40V，电流54mA，功率9W，时间3h；封闭时间1h。

CYP1A2（1∶500），CYP2B1（1∶500），CYP2D1（1∶1000），CYP2E1（1∶1000），CYP3A（1∶500）和山羊抗GADPH（1∶500）一抗常温孵育1h，4℃过夜；山羊抗小鼠（1∶5000），山羊抗兔（1∶5000）和兔抗山羊（1∶5000）二抗常温孵育1h。

2.3.3条带分析每个条带加发光液200～300μL，用ImageQuantLAS500测量每个条带的荧光值，用ImageJ图像处理软件分析灰度值。

2.4数据分析

所得的相关实验数据以±s表示，运用SAS统计软件进行统计，t检验代表2组间的比较，F检验代表多组间的比较，P<0.05时，表示各组间存在统计学意义。

3结果

3.1人参总皂苷（GTS）对辐射后大鼠主要CYPs酶活性的影响

与对照组比较，辐射对CYP2B1和CYP3A4有显著的诱导作用（P<0.05）；对CYP1A2和CYP2C₉有诱导作用，但无显著性差异；对CYP2D1有抑制作用，但无显著性差异。与辐射组相比，人参总皂苷（80mg·kg^-1·d^-1）对CYP2B1，2C₉，3A4有显著的抑制作用（P<0.05），对CYP1A2，CYP2D1无明显影响，见表3。

3.2人参总皂苷（GTS）对辐射后大鼠P450酶

mRNA表达的影响

3.2.1CYP1A2mRNA与空白组相比，辐射（IR）组和苯巴比妥（BT）组CYP1A2mRNA表达明显上调（P<0.05）；与IR组比较，GTS（80mg·kg^-1·d^-1）CYP1A2mRNA表达明显下调（P<0.05），见图1。

与空白组相比1）P<0.05；与IR组相比2）P<0.05（图2～10同）。

图1人参总皂苷对辐射后大鼠肝CYP1A2mRNA表达调节作用

Fig.1EffectsoftotalginsenosideontheexpressionofCYP1A2mRNAofP450sofratsbyirradiation

3.2.2CYP2B1mRNA与空白组相比，IR组和BT组CYP2B1mRNA表达明显上调（P<0.05）；与IR组比较，GTS（80mg·kg^-1·d^-1）CYP2B1mRNA表达明显下调（P<0.05），40mg·kg^-1·d^-1有抑制趋势，但无显著性差异，见图2。

图2人参总皂苷对辐射后大鼠肝CYP2B1mRNA表达调节作用

Fig.2EffectsoftotalginsenosideontheexpressionofCYP2B1mRNAofP450sofratsbyirradiation

3.2.3CYP2D1mRNA与空白组相比，IR组CYP2D1mRNA表达明显下调（P<0.05），BT组CYP2D1mRNA表达明显上调（P<0.05）；与IR组比较，GTS（20和40mg·kg^-1·d^-1）CYP2D1mRNA表达明显上调（P<0.05），80mg·kg^-1·d^-1的CYP2D1mRNA表达呈抑制趋势，但无明显差异，见图3。

图3人参总皂苷对辐射后大鼠肝CYP2D1mRNA表达调节作用

Fig.3EffectsoftotalginsenosideontheexpressionofCYP2D1mRNAofP450sofratsbyirradiation

3.2.4CYP2E1mRNA与空白组相比，IR组CYP2E1mRNA表达有诱导趋势，但无显著性差异，BT组CYP2E1mRNA表达明显上调（P<0.05）；与IR组比较，GTS（80mg·kg^-1·d^-1）mRNA表达明显下调（P<0.05），见图4。

图4人参总皂苷对辐射后大鼠肝CYP2E1mRNA表达调节作用

Fig.4EffectsoftotalginsenosideontheexpressionofCYP2E1mRNAofP450sofratsbyirradiation

3.2.5CYP3A4mRNA与空白组相比，IR组和BT组CYP3A4mRNA表达明显上调（P<0.05）；与IR组比较，GTS（80mg·kg^-1·d^-1）CYP3A4mRNA表达明显下调（P<0.05），见图5。

3.3人参总皂苷（GTS）对辐射大鼠P450酶蛋白表

图5人参总皂苷对辐射后大鼠肝CYP3A4mRNA表达调节作用

Fig.5EffectsoftotalginsenosideontheexpressionofCYP3A4mRNAofP450sofratsbyirradiation

达的影响

3.3.1CYP1A2与空白对照组相比，辐射组（IR）和苯巴比妥组（BT）CYP1A2蛋白表达明显上调（P<0.05）；与IR组比较，人参总皂苷（40，80mg·kg^-1·d^-1）CYP1A2蛋白表达明显下调（P<0.05），见图6。

图6人参总皂苷对辐射后大鼠肝CYP1A2蛋白表达调节作用

Fig.6EffectsoftotalginsenosideontheexpressionofCYP1A2proteinofP450sofratsbyirradiation

3.3.2CYP2B1与空白组相比，IR组和BT组CYP2B1蛋白表达明显上调（P<0.05）；与IR比较，GTS（40，80mg·kg^-1·d^-1）CYP2B1蛋白表达明显下调（P<0.05），见图7。

3.3.3CYP2D1与空白组相比，IR组BT组CYP2D1蛋白表达有抑制和诱导趋势，但无显著性差异；与IR组比较，GTS（40，80mg·kg^-1·d^-1）

图7人参总皂苷对辐射后大鼠肝CYP2B1蛋白表达调节作用

Fig.7EffectsoftotalginsenosideontheexpressionofCYP2B1proteinofP450sofratsbyirradiation

CYP2D1有抑制趋势，但无显著性差异，见图8。

图8人参总皂苷对辐射后大鼠肝CYP2D1蛋白表达调节作用

Fig.8EffectsoftotalginsenosideontheexpressionofCYP2D1proteinofP450sofratsbyirradiation

3.3.4CYP2E1与空白组相比，IR组和BT组CYP2E1蛋白表达明显上调（P<0.05）；与IR组比较，GTS（20，40，80mg·kg^-1·d^-1）CYP2E1蛋白表达明显下调（P<0.05），见图9。

3.3.5CYP3A4与空白组相比，IR组和BT组CYP3A4蛋白表达明显上调（P<0.05）；与IR组比较，GTS（20，40，80mg·kg^-1·d^-1）CYP3A4蛋白表达明显下调（P<0.05），见图10。

4讨论

随着人们对核能的不断开发和利用，接触到辐

图9人参总皂苷对辐射后大鼠肝CYP2E1蛋白表达调节作用

Fig.9EffectsoftotalginsenosideontheexpressionofCYP2E1proteinofP450sofratsbyirradiation

图10人参总皂苷对辐射后大鼠肝CYP3A4蛋白表达调节作用

Fig.10EffectsoftotalginsenosideontheexpressionofCYP3A4proteinofP450sofratsbyirradiation

射的几率大大增加（从事与辐射有关的工作人员以及进行放疗的患者），从而危害着人们身体健康。肝脏是人体最重要的代谢器官之一，参与代谢有害、有毒物质。近年来，研究人员发现辐射能对肝脏中的相关代谢酶功能造成一定的损伤[8]。人参在临床上作为补气、安神和增强免疫一类药物，具有抗辐射损伤的作用，但对辐射后P450酶有无作用尚未报道。因而，研究人参调节辐射对P450酶损伤不仅可以为辐射对机体损伤性研究提供数据支撑，而且为开发天然抗辐射药物提供新的思路。本课题从药物代谢酶角度，研究人参对辐射后大鼠P450酶的干预作用。

本研究采用3种方法（Cocktail混合探针结合液质联用，qPCR和Westernblot法）检测P450的各项指标（酶活性、mRNA和蛋白表达），能直观地反应出P450受辐射的影响程度和人参对辐射的干预效果。结果显示，P450酶活性的变化可能是通过基因转录控制；人参总皂苷（40，80mg·kg^-1·d^-1）对辐射诱发CYP1A2，CYP2B1，CYP2E1，CYP3A4酶活性上调变为下调，延长药物的作用时间；人参总皂苷20mg·kg^-1·d^-1对辐射诱发CYP2D1酶活性下调变为上调，加快药物的代谢速率。人参总皂苷对辐射后大鼠P450酶的干预作用可能与人参总皂苷对大鼠P450的抑制作用有关，具体是直接抑制P450酶，还是通过其他途径，尚不清楚，还需进一步研究。人参总皂苷对辐射后P450酶有抑制作用，因而放疗患者的治疗中要实时监测血药浓度，保证患者的用药安全。因人参总皂苷内含有多种皂苷成分，到底哪些成分起到相应的抗辐射损伤的效果还需要进一步研究。

[参考文献]

[1]IoannidesC，LewisDF.CytochromesP450inthebioactivationofchemicals[J].CurrTopMedChem，2004，4：1767.

[2]GhanayemBI，HofflerU.Investigationofxenobioticsmetabolism，genotoxicity，andcarcinogenicityusingCYP2E1（-/-）mice[J].CurrDrugMetab，2007，8：728.

[3]HuttunenKM，MahonenN，RaunioH，etal.CytochromeP450activatedprodrugs：targeteddrugdelivery[J].CurrMedChem，2008，15：2346.

[4]严敏芬，郝福荣，许立明，等.3Gyγ射线照射和丝裂霉素C对大鼠肝脏细胞色素P450含量及其同工酶CYP2B1，CYP2E1活性的影响[J].辐射研究与辐射工艺学报，2005，23（4）：236.

[5]HyeChinChung，SoHeeKim，MyungGullLee，etal.MitochondrialdysfunctionbygirradiationaccompaniestheinductionofcytochromeP4502E1（CYP2E1）iatliver[J].Toxiology，2001，161：79.

[6]张红曦，王宇光，马增春，等.参麦注射液对大鼠肝脏CYP450酶的影响[J].中国新药杂志，2013，22（21）：2529.

[7]梁淼，马增春，易剑峰，等.四物汤及其配伍对大鼠肝脏P450酶活性及mRNA表达的影响[J].中国中药杂志，2013，38（21）：3720.

[8]傅尚志.电离辐射对肝脏的损伤[J].国外医学·放射医学核医学分册，1997，21（4）：188.

[责任编辑马超一]

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