摘 要：本文研究了CuSO4对泥鳅胚胎发育的影响，结果表明：CuSO4对胚胎早期致畸作用不明显；对胚胎中后期（尾芽期）致畸作用明显，表现为尾芽变短，眼囊和头部发育不完全，身体弯曲，黑色素不明显；在相同的条件下，随着CuSO4浓度增大，泥鳅胚胎的成活率和孵化率降低，死亡率和畸形率上升；硫酸铜对泥鳅的24hLC50为1.362 mg/L，48hLC50 为1.132mg/L，安全浓度SC为0.2823mg/L。
关键词：泥鳅；CuSO4；胚胎发育
泥鳅Misgurnus anguillicaudatus 属于鲤形目鳅科泥鳅属，味道鲜美，肉质细嫩，营养丰富。如人们俗语所说：“天上的斑鸡，地上的泥鳅”，它是有名的美味佳品，素有“水中人参”之称。目前CuSO4作为杀虫、灭藻、消毒药在水产养殖上广泛应用。也有学者对泥鳅毒性试验有详细的报道，但CuSO4对泥鳅胚胎的影响没见详细研究报告。为了进一步了解硫酸铜对泥鳅胚胎的毒性作用，我们做了硫酸铜对泥鳅胚胎发育的相关研究，提供有关基础数据。
一、材料与方法
（一）材料
试验用的泥鳅购自荣昌梅石坝养殖场，挑选体形端正，体质健壮，无病无伤，体色正常，性腺成熟，雄鳅在10～13cm体重达12g以上，雌鳅在15cm体重达18g 以上。催产药物：绒毛膜促性腺激素（HCG），每尾注射600IU，雄性减半，CuSO4：其含量以CuSO4·5H2O计% ≥ 98.5%，9%的甲醛，曝气自来水，显微镜1台，培养皿18个，吸管1个，200mL量筒1个。
（二）方法
于2014年5月人工催产、授精，获得受精卵。受精卵在20±2℃室温条件下孵化，选择正常发育到原肠早期的胚胎进行试验。
1.试验分组： 试验设5个药物浓度组和一个对照组，各浓度分别设3个重复，处理时间5 min；CuSO4浓度依次为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mg/L，对照组为曝气自来水。
2.试验方法：将受试胚胎40粒置于350ml培养皿中，用药物或清水浸泡5min后用清水洗涤4次，再放回培养皿中继续孵化，每隔1h换一次水。对胚胎连续取样进行显微观察，从原肠中期到出膜每隔30min取样一次，从出膜到鳔出现每隔3h取样一次，若发现胚胎发育停止或有明显畸形（与空白组做比较）者立即用9%的甲醛固定，贴上标签，在显微镜下观察形态结构变化。
（三）指标测定
胚胎发育时序：依据杨荣华等人关于泥鳅胚胎与鱼苗发育研究的方法进行
孵化率：孵化出膜个数/试验用于胚胎发育数 × 100%
成活率：胚胎发育到鳔出现期个数/试验用于胚胎数 × 100%
畸形率：畸形数/试验用于胚胎发育数 × 100%
胚长：用目镜测微尺测量胚体长（在重合后台测微尺的格数为89，目测微尺35，即目镜测微尺的一个小格为：（89×10/35=25.43um=0.02543mm）
（四）半致死浓度和安全浓度的计算
根据在24 h、48 h各种不同浓度药液中受试死亡的百分数。求死亡率与药物浓度的回归方程，通过回归方程求半致死浓度（LC50），并应用F检验对回归方程的相关性进行检验。安全浓度（SC）根据24h和48h的半致死浓度求得：
采用Karrer法计算半致死浓度，计算公式：
半致死浓度计算公式：；式中：——半致死浓度；Xm——最大浓度组的对数值；i——相邻两浓度组之间浓度对数的差值；∑P——各浓度组死亡率总和。
安全浓度计算公式：SC=（48hLC50×0.3）/（24hLC50/48hLC50）2
（五） 统计分析
试验结果数据以平均值+标准误表示，采用SPSS13.0对数据进行单因素方差分析Tukey氏多重比较，差异显著水平为P<0.05。以直线式来拟合成活率率、孵化率、死亡率、畸形率、胚胎长度与硫酸铜药物浓度之间的相关关系。
二、结果
（一）硫酸铜含量对泥鳅胚胎发育的影响
1.硫酸铜含量对泥鳅胚胎发育时序的影响
由表1可知，试验组胚胎发育出膜时间都比对照组延长，其中Ⅰ延长0.27h，其他组都至少延长2.39h，其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ发育到鳔出现期，发育时间比对照组推迟，在这个过程中发育顺序与对照组一致。
2.硫酸铜含量对泥鳅胚胎发育的影响
由表2可知，试验组（除Ⅰ组外）的24h死亡率、48h死亡率显著高于对照组，Ⅰ组与对照组差异不显著（P﹥0.05），其它各组差异显著（P﹤0.05），24h死亡率第Ⅴ组最大（100%），48h死亡率第Ⅳ、Ⅴ最大（100%）；试验组（除Ⅰ组外）的孵化率显著低于对照组，Ⅰ组与空白组组差异不显著（P﹥0.05），其它各组差异显著（P﹤0.05），空白组组孵化率最大（85%）；试验组（除Ⅰ组外）的成活率显著低于对照组，Ⅰ组与空白组组差异不显著（P﹥0.05），其它各组差异显著（P﹤0.05），Ⅵ组成活率最大（85%）；试验组的畸形率显著高于对照组，Ⅱ组与Ⅲ组差异不显著（P﹥0.05），其他各组差异显著（P﹤0.05），Ⅴ组畸形率最大（35.8%），在这个过程中畸形作用主要发生在尾芽期，出瞙前期（外部形态观察），由图1可知，出现畸形胚胎比正常发育直径小，尾芽期，尾牙发育萎缩，出膜期出现尾部弯曲、烂眼、瞎眼现象。
分别以试验过程中泥鳅胚胎的死亡率、孵化率、成活率、畸形率为因变量（Y），以硫酸铜含量作为自变量（X）列回归方程：
24h死亡率与硫酸铜含量的回归方程：
根据此回归方程的最优解（2.44mg/L）可知，当硫酸铜含量为（2.44mg/L）时，泥鳅胚胎24h死亡率最大为100%。
48h小时死亡率与硫酸铜含量的回归方程：
根据此回归方程的最优解（2.26mg/L）可知，当硫酸铜含量为（2.26mg/L）时，泥鳅胚胎48小时最大死亡率为100%。
因此，安全浓度SC=1.362 x 0.3/（1.362/1.132）2 =0.2823mg/L
孵化率与硫酸铜含量的回归方程：
根据此回归方程的最优解（0.18mg/L）可知，当硫酸铜含量为（0.18mg/L）时，泥鳅胚胎孵化率最优解为85%。
成活率与硫酸铜含量的回归方程：
根据此回归方程的最优解（0.10mg/L）可知，当硫酸铜含量为（0.10mg/L）时，泥鳅胚胎成活率最优解为85%。
畸形率与硫酸铜含量的回归方程：
根据此回归方程的最优解（2.68mg/L）可知，当硫酸铜含量为（2.68mg/L）时。泥鳅胚胎最大畸形率为35.8%。
3. 硫酸铜含量对泥鳅胚胎长度的影响
由表3可知，试验组的胚胎长度显著短于对照组，其它各组差异显著（P﹤0.05），空白组组的胚长（原肠后期、尾芽期、肌肉效应期、出瞙前期的胚长为0.89、0.98、1.00、1.06mm）最长，Ⅴ组的胚长（原肠后期、尾芽期、肌肉效应期、出膜前期的胚长为0.83、0.90、0.90、0.90mm）最短。
分别以试验过程中泥鳅胚胎的的长度因变量（Y），以硫酸铜含量作为自变量（X）列回归方程：
根据此4个回归方程的最优解可知：当硫酸铜含量为（0.18mg/L）时，原肠期胚胎的长度最优解为0.89mm；当硫酸铜含量为（0.17mg/L）时，尾芽期胚胎的长度最优解为0.98mm、当硫酸铜的含量（0.10mg/L）时，肌肉效应期胚胎的长度最优解为1.00mm；当硫酸铜的含量在（0.07mg/L）时，出膜前期胚胎的长度最优解为1.06mm。
Figure 6 Copper sulfate on the length of loach embryos embryos
回归曲线见图2、3、4、5、6综合考虑泥鳅胚胎在发育过程中的成活率、死亡率、畸形率、孵化率、胚胎长度等因素，当硫酸铜含量在区间为（0.10～0.2823mg/L）时，泥鳅胚胎发育能达到成活率、孵化率、畸形率、死亡率、胚长能达到较优水平。
三、讨论
（一） 硫酸铜的作用机理
硫酸铜的作用机理是与细胞蛋白结合，产生蛋白盐沉淀。铜在动物体内参与铁的吸收及新陈代谢，为血红蛋白合成及细胞成熟所必须的，同时也是软体动物和节肢动物血蓝蛋白的组成成分，作为血液的氧载体参与氧的运输。也是细胞色素氧化酶、酪氨酸酶和抗坏血酸氧化酶的成分，具有影响体色素形成、骨骼发育和生殖系统及神经系统的功能。当体内或水体中的硫酸铜过量时，损伤红细胞引起溶血和贫血。通常铜进入体内后主要在组织中累积，一旦超过组织的处理水平时，Cu2+即释放入组织中，过量的Cu2+与CAT（过氧化氢酶）上的-SH巯基氧化成SO2 ，从而改变CAT的结构，抑制其活性，Cu2+与-SH巯基结合后在红细胞中大量积集，引起酶系统的氧化失活，损伤红细胞，增加细胞膜的通透性，破坏其稳定性并使细胞质和细胞器易于受损，变性血红蛋白增加使细胞膨胀破裂。另一方面，铜与血红蛋白结合形成Heinz（变性珠蛋白小体）小体，使细胞内葡萄糖6-磷酸脱氢酶、谷胱甘肽还原酶失活，还原型谷胱甘肽减少，导致血红蛋白的自动氧化加剧，变性血红蛋白大量进入血液，最终导致溶血、贫血和pr变性。因此，当硫酸铜含量超过胚胎组织的处理水平，会使新陈代谢减缓，影响其胚层的分化。
（二）硫酸铜浓度对胚胎发育时序的影响
试验证明硫酸铜的不同药物浓度对胚胎发育时间的影响明显，随着浓度升高发育速度减缓。可能是Cu2+能穿透生物膜，进入胚胎组织里与SH结合，发生氧化作用，刺激生物膜通透性变大，导致Cu2+在组织内累积，导致细胞分化减缓，从而胚胎发育减缓。
在水温23～27℃，姚纪花在大鳞副泥鳅（Paramisgurnus dabryanus）当中硫酸铜浓度在1.6ppm和3.2ppm组，胚胎孵化出膜，分别用了22.5h、21h.，空白组用了24h。
表1表明，空白组、0.5ppm、1.0ppm、1.5ppm、2.0ppm、2.5ppm浓度组分别用了21.52h、21.92h、22.60h、23.83h、23.92h、24.25h，水温在20±2℃，第Ⅱ-Ⅴ比空白组的时间延长1-3h，与大鳞副泥鳅空白组相差3h。本次试验组、姚纪花的第Ⅴ、Ⅵ组都比空白组高了1.5h、3h，本组与姚纪花的浓度组胚胎发育时间都比空白组延长。说明不同物种，胚胎发育速度不一样，但毒性作用明显。因为铜离子减缓了细胞的的分化，从而导致胚胎发育时间延长。
水温在20～23℃，在张明宇在泥鳅胚胎发育当中，空白组时相从原肠期到出膜用了20h。本组试验胚胎发育时间比张明宇的空白组延长1.65h。说明随着温度的升高，能加快泥鳅胚胎的发育。
观察发现试验胚胎发育时序与对照组相同，发育速度比对照组减缓。泥鳅胚胎在视液泡形成期，第Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ都比对照组延长半个小时，在尾芽期时，第Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组延长了一个小时以上。说明试验胚胎的中后期发育速度与正常对照组胚胎有明显差距。在张梅芬认为：从外部形态观察，大鳞副泥鳅试验胚胎的早期发育速度与正常对照组胚胎无明显的差异。眼黑色素期后，畸形程序较轻微的D1组除卵黄吸收较为缓慢外，其他与正常胚胎的发育基本相同。可能原因是这样：两种鱼的形态虽相近，但并非同一物种，因而是生活习性不同，大鳞副泥鳅生活在条件较好的江河湖泊，而泥鳅栖息于浅水湖塘，水田和沼泽中。另一方面可能是亲本已受到较多的污染、毒性实验时显示出更为敏感的特性。
（三） 药物浓度对胚胎死亡率、孵化率、成活率的影响
结果证明硫酸铜在高浓度下对泥鳅胚胎致死、孵化率、成活率明显增强，低浓度组中的胚胎发育进程与对照组相近。表2 表明，在1.0ppm、1.5ppm的浓度下，胚胎出膜的死亡率、成活率与孵化率的都在50%左右，在2.0ppm的浓度下，死亡率、达到90%以上、孵化率达到15%、成活率为0%，而0.5ppm浓度组与对照组相近。可能是硫酸铜的毒性较大。一方面是与它的强渗透力有关。同时，还与试验铜液中的“SO2+”有关，因为通常铜的毒性随摄入少量的SO2+而增高的。结果也显示硫酸铜的毒性作用有不相同处：低浓度下都可以接受，对发育及成活率无明显影响，但随着剂量的增高，都可见的致畸胎性，并很快出现胚体死亡，而且在正常和死亡之间存在一个狭义的剂量带。这一结论与对泥鳅及白鲢等鱼类的研究结果也相一致。
在杨启超等学者在研究硫酸铜对泥鳅毒性试验报道中。成鳅的48hLC50为2.70mg/L、安全浓度为0.26mg/L。本次试验的48hLC50为1.132mg/L、安全浓度为0.2823mg/L，说明硫酸对铜泥鳅胚胎毒性作用比成鳅、仔鱼的毒性弱。是因为卵膜对其卵内的组织有保护作用，从而是卵内组织受到破坏较小，当铜离子在组织内达到一定量的时候，就会出现组织麻痹。与何利君等学者在研究重金属Cu2+离子对淡水石斑鱼胚胎及仔鱼急性毒性的结论相同。
（四）药物浓度对胚胎畸形率的影响
结果表明，随着硫酸铜浓度增大，畸形率升高。通过观察胚胎发育发现第Ⅰ组胚胎除眼囊发育不明显及卵黄吸收较为缓慢外，其他与正常胚胎无明显差异，第Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组的胚胎则自原肠期后，出现异常。在视液泡形成期，畸形胚胎的视液泡比正常的胚胎稍小的现象，在尾芽期时，畸形胚胎肌节数量比正常胚胎有减少的现象。在图1可以看出，胚胎发育到荱牙期后，就出现了荱牙变短，眼囊发育不完全，头部发育不完全，身体弯曲；出膜后畸形胚胎，形态不一，眼睛、躯干、头部等发育不完，全出现烂眼、瞎眼，黑色素不明显。在与张梅芬观察外部形态在发育过程中，出现异常本组情况基本上是一致的。还观察发现，胚胎在尾芽期、出膜后期的两个阶段，死亡率高，说明胚胎在受重金属的影响下作用明显，因为，胚胎中由外胚层分化形成的晶体、表皮、及皮肤衍生物等，及由中胚层诱导外胚层分化的眼、脑、肌肉等，在过量的Cu2+影响其发育异常，而由内胚层分化的组织如咽、食道、肠及内耳等部分的发育基本正常。张梅芬认为氯化锂主要引起中胚层及其诱导的外胚层的分化出现障碍。而对内胚层的分化影响不大。同理，硫酸铜也影响了胚胎中外胚层的分化，导致胚胎发育和器官分化不完全。
（五）药物浓度对胚胎长度的影响
结果表明药物浓度对胚胎的长度影响明显。表3表明胚胎出膜时，浓度组胚长分别比对照组缩短了0.03mm、0.05mm、0.07mm、0.10mm、0.16mm说明在高浓度下作用明显。一方面是Cu2+在组织内大量的累积，影响其组织内的钙、铁、V（维生素）等的吸收，从而导致其组织发育不完全。另一方面是高浓度下硫酸铜影响胚胎的新陈代谢减缓，影响其中外胚层的分化，导致分化不完全，胚长增长缓慢。
四、结论
经过这次试验，结果表明硫酸铜对泥鳅胚胎的影响比成鳅、仔鱼弱，其安全浓度是0.2823mg/L，在过量的硫酸铜含量对你对泥鳅的中后期发育影响明显。还观察发现本次试验没有中水霉卵现象，在安全浓度处理下，能提高孵化率。
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