[摘要] 目的 比较非毒性结节性甲状腺（NTNG）组织和正常甲状腺组织整体蛋白质表达，以研究非毒性结节性甲状腺组织蛋白质表达差异。 方法 提取NTNG甲状腺组织和正常甲状腺组织总蛋白，利用双向凝胶电泳技术分离各组总蛋白；经MALDI- TOF / TOF质谱分析，搜索数据库，寻找匹配的相关蛋白质，鉴定蛋白质，获得差异蛋白质的信息。 结果 经过初步筛选和质谱分析共获得9个具有统计学意义的表达差异蛋白点，其中4个在非毒性结节性甲状腺高表达，5个低表达。 结论 NTNG与正常腺体组织间存在多种差异表达的蛋白质，可能通过细胞外基质、细胞因子、受体信号转细胞信号传递等参与NTNG的发生和发展。
[关键词] 蛋白质组学；非毒性结节性甲状腺肿；蛋白质表达
[中图分类号] R581 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2013）24-23-03
Primary study on the difference of protein expression of nontoxic nodular goiter
YAO Jinke HU Caixue WU Genggang HE Wenguang
Department of General Surgery， Zengcheng People"s Hospital， Zengcheng 511300，China
[Abstract] Objective To analyze the comparison of overall protein expression between nontoxic nodular goiter （NTNG） tissues and normal thyroid tissues， and to explore the difference of protein expression of NTNG. Methods Total proteins of NTNG tissues and normal thyroid tissues were extracted and separated via two-dimensional gel electrophoresis； the proteins were analyzed via MALDI-TOF/TOF mass spectrum， relevant proteins were matched in searching of database and then identified， and finally the information of different proteins were obtained. Results Nine differentially expressed protein spots which were statistically significant were obtained via primary screening and analysis of mass spectrum， four of which showed high expression in NTNG tissues， while five of which showed low expression. Conclusion There are various types of differentially expressed proteins between NTNG and normal thyroid. Extracellular matrix， cytokines， trans-cellular transduction of receptor signals are likely to be involved in the onset and development of NTNG.
[Key words] Proteomics； Nontoxic nodular goiter（NTNG）； Protein expression
非毒性结节性甲状腺肿（nontoxic nodular goiter，NTNG）是一种常见的甲状腺疾病，发病率可高达6%～7%。以女性多见。与正常的甲状腺细胞相比，非毒性结节性甲状腺肿的甲状腺细胞在蛋白质水平上应有差异。利用这方面的指标的差异，研究非毒性结节性甲状腺肿表达存在差异的相关蛋白质的变化，有助于阐明其发生发展的机制。现利用蛋白质组技术，初步研究分析NTNG患者甲状腺组织及正常甲状腺组织之间表达明显差异的蛋白质。
1 材料与方法
1.1 实验标本
所有标本均取自增城市人民医院2009年10月～2011年10月住院患者，平均年龄（41.3±11.2）岁。NTNG患者共4例（男2例，女2例）。正常对照4例取自无甲状腺病变患者的正常甲状腺组织（男3例，女1例）。均经病理确诊。所有手术切除甲状腺标本收集后均立刻放入-80℃超低温冰箱中。
1.2 方法
1.2.1 主要试剂与仪器设备 Tris 饱和酚（美国Amresco
公司）、碘乙酰胺、过硫酸铵、硫脲、四甲基乙二胺、尿素、丙烯酰胺、苯甲基磺酰氟、甘氨酸；Amersham Bioscience银染试剂盒；考马斯亮蓝G250（Bio Basic Inc 公司）和溴酚蓝；非线性IPG 干胶条（24cm， pH 3～10， Bio-Rad 公司）；CHAPs（Usb 公司）；十二烷基硫酸钠和胰蛋白酶（Promega 公司）。ETTAN DALT six 电泳槽和灌胶装置和ETTAN IPGPHOR3 等电聚焦仪（General Electric公司）；4800型MALDI-TOF-TOF质谱分析仪（ABI公司）。
1.2.2 蛋白样本制备 取超低温保存的组织标本100mg 加入液氮后研磨成粉，加入裂解液0.8mL（配方：1mmol/L PMSF，2mol/L Thiourea，2%CHAPs（W/V），20mmol/L Tris，7mol/L Urea，加适量HCl 配成pH=8.5的溶液），溶解充分后移至1.5mL EP管，超声助溶（80W，0.7s，间隔0.8s，11次），上清液4℃，150 000×g 超速离心45min，小心避开上层漂浮的脂质层，吸取离心上清6℃ 40 000×g 再次离心50min。Bradford 法定量，分装后置-75℃保存。
1.2.3 双向电泳 分析型凝胶，上样量300μg；制备型凝胶，上样量1200μg。参考IPGphorTM进行第一向电泳等点聚焦：在PGPHOR3等电聚焦仪上进行，程序：20℃，电流50μA/胶，200V 1h，500V 1h，1000V 1.5h，8000V 5h。胶条平衡后，参考Etten Dalt IITM指南进行第二向电泳SDSPAGE（5W/gel 45min，20W/gel 6h），待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即停止电泳。
1.2.4 凝胶染色 分析型凝胶用银染试剂盒进行硝酸银染色；制备型凝胶用考马斯亮蓝G-250染色，每种液体用量为250mL/胶，所有步骤均在摇床上进行。
1.2.5 凝胶的扫描及质谱分析 对双向电泳染色后的凝胶经256灰阶模式扫描，获得扫描图像，用软件（Image Master 2D platinum 5.0）进行图像分析蛋白质点，寻找表达差异的蛋白质点。将表达差异明显的蛋白质点编号切点，经胶内蛋白酶解后，进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS），用软件分析数据，鉴定蛋白质。搜索NCBI及 UniPort数据库，寻找匹配的相关蛋白质及鉴定蛋白质。
2 结果
2.1 NTNG及正常甲状腺组织的双向电泳图谱
NTNG及正常甲状腺组织分别检测到771个及738个蛋白质点。见图1～2。
图1 NTNG双向电泳图谱
2.2 差异表达的蛋白的质谱分析
对NTNG和正甲状腺双向凝胶电泳的硝酸银染色的图谱进行图像分析匹配，选出重复性强且在各组间差异性比较结果一致的蛋白点并肽段抽提，然后进行肽指纹图谱鉴定，再在NCBI 数据库搜索，获得匹配的蛋白质。在得到的鉴定产物中除去胶原蛋白VI、血清白蛋白以及波形蛋白3等细胞结构蛋白，筛选出NTNG和正常甲关腺组织之间有差异表达明显的蛋白点9个，其中4个蛋白斑点在NTNG 中表达较
图2 正常甲状腺双向电泳图谱
高，5个蛋白斑点在NTNG中表达较低（表1）。查询UniPort数据库，得到这些表达有差异的蛋白质相关信息（表2）。
3 讨论
非毒性结节性甲状腺肿是一种分布广泛的世界性疾病。发病率可高达6%～7%[1-2]。以女性多见。NTNG伴发甲状腺癌一向受到重视，其发生率可高达4.0%～17.0%[3]。研究者普遍认为，NTNG的致病机制与激素、生长因子和甲状腺滤泡的功能异质性等因素有关。但这些研究多是从某一方面的，指标比较单一，具有一定的局限性。客观上NTNG病变存在部分特异蛋白质，寻找并研究这些特异蛋白质在NTNG中的作用及相关机制有助于明确NTNG发生发展的机制。而蛋白组学技术正可通过分析NTNG与正常组织的比较完整蛋白表达谱并发现两者间表达差异明显的的蛋白质。已有学者应用蛋白质组学技术对甲状腺癌进行了研究[4-6]。本研究通过分析NTNG 与正常甲状腺组织蛋白质双向电泳图谱，对表达差异明显的蛋白点进行质谱分析鉴定，并查询了UniPor数据库，获得了这些蛋白的功能，发现这些蛋白可能通过细胞的受体信号转细胞信号传递途径、细胞因子、细胞外基质参与了NTNG 的发生、发展过程。其中表达差异常较为显著的蛋白质有9个，上调的有：Zinc finger CCHC domain-containing protein 12、Dipeptidyl peptidase 4、Matrix metalloproteinase-9、72 kDa type IV collagenase；下调的有：Fatty acid synthase、HLA class II histocompatibility antigen， DR beta 4 chain、proenkephalin、E3 ubiquitin-protein ligase TRIM36。目前MMP-9在NTNG研究中很少报道。多数的研究生发现其与多种肿瘤的侵袭转移[7-10]
表1 非毒性结节性甲状腺肿中差异表达蛋白的基本特征
蛋白名称编号电离/飞行时间
质谱序列覆盖（%）分子量
（Da）蛋白质
等电点蛋白质评分表达量备注
Zinc finger CCHC domain-containing protein 12GI：2855779035129 5288.56961.5+
Dipeptidyl peptidase 4GI：1876569432 88 2785.67781.2+
Matrix metalloproteinase-9GI：25833033 78 4585.691211.3+
72 kDa type IV collagenaseGI：1134266633 73 8825.26894.1+
Autoantigen p27GI：298267322 21 4745.12106-3.0-
Fatty acid synthaseGI：124576923 273 4266.0169-1.1-
HLA class II histocompatibility antigen， DR beta 4 chainGI：5263034424 29 9416.95130-2.7-
proenkephalinGI：2161911223 28 385 6.07141-1.4-
tripartite motif-containing 36GI：12065982032 83 0135.7793-2.5-
表2 表达差异显著的蛋白质在UniPort 数据库的相关信息
蛋白质名称基因名称亚细胞定位功能
Zinc finger CCHC domain-containing protein 12ZCCHC12细胞核BMP信号通道的转录辅激活物
Dipeptidyl peptidase 4DPP4或 CD26细胞表面，顶端质膜T细胞共活化
Matrix metalloproteinase-9MMP9细胞内分泌至细胞外及细胞外基质细胞外基质的蛋白质水解及白细胞迁移
72 kDa type IV collagenaseMMP2细胞核、细胞质、线粒体，分泌至细胞外及细胞外基质多种功能：血管重建、血管生成、组织重建、肿瘤侵袭、炎症、动脉粥样硬化斑块等。可下调细胞外基质蛋白及非基质蛋白
Autoantigen p27SSSCA1 或 P27细胞核与细胞周期、细胞分裂有关，参与有丝分裂。 抗原分子
Fatty acid synthaseFAS
细胞质、黑色体催化acetyl-CoA， malonyl-CoA 及 NADPH形成长链脂肪酸
HLA class II histocompatibility antigen， DR beta 4 chainHLA-DRB4细胞膜、内质网膜、高尔基器，反高尔基网膜，核膜，溶酶体膜，晚期胞内体膜结合已接近抗原呈递细胞内吞通道的抗原的多肽，并呈递至细胞表面，以备CD4 T细胞识别
proenkephalinPENK不清楚甲硫脑啡肽及亮内啡呔，能竞争及模拟阿片药物的作用。参与痛觉及应激反应；可增加纹状体谷氨酸盐的释放；降低纹状体中GABA 的浓度
E3 ubiquitin-protein ligase TRIM36TRIM36细胞质、细胞质囊、分泌小泡，细胞骨架染色体分离及细胞周期调控
有关，亦有学者研究发现MMP-9对良性病变[11-13]有一定的作用。程青等[14]指出MMP-9/TIMP-1失衡在肺气肿形成中起重要作用。詹阳等[15]发现在正常甲状腺组织、良性甲状腺结节和甲状腺乳头状癌中MMP-9 mRNA表达随着细胞异型性的增加呈上调的趋势。本组在NTNG中MMP-9亦为上调。Autoantigen p27（p27）为抑癌基因，能使细胞周期停滞于G1期从而阻止细胞增殖[16-17]，对真核细胞周期调控的起重要作用。冯刚等[18]研究发现结节性甲状腺肿组织p27蛋白表达水平明显低于周围正常甲状腺组织，并指出p27蛋白可能参与了TSH通过细胞膜受体介导的信号传导通路从而影响滤泡上皮细胞分泌甲状腺激素功能。提示细胞内p27蛋白低表达对失去了抑制结节性甲状腺肿发展的作用。本组研究亦发现p27表达下调，说明结节性甲状腺肿的发生发展可能与p27蛋白表达受到抑制有关。综上所述，从本组研究表明NTNG发生发展存在多种差异蛋白，可能与细胞外基质、细胞因子、受体信号转细胞信号传递等相关的差异表达蛋白质有关。其发生与多种因素有关，但由于研究的样本有限，需进一步扩大研究。虽然这些差异表达的蛋白质的意义还不很清楚，但为深入研究NTNG的发生发展机制提供了有价值的线索，在寻找NTNG的发病因素及治疗方面具有积极的意义。
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（收稿日期：2013-10-17）