[摘要] 目的 将胃癌肝高转移潜能细胞特异性结合肽pd20与人肿瘤坏死因子α（TNF-α）进行基因融合，并构建原核表达载体，表达pd20-TNF-α融合蛋白。 方法 利用全基因合成法制备pd20-TNF-α融合基因，构建pd20-TNF-α原核表达载体，在大肠杆菌BL21中进行诱导表达。对表达产物进行SDS-PAGE电泳分析和Western blot检测分析。 结果 成功构建了pd20-TNF-α重组融合质粒，表达的蛋白经SDS-PAGE电泳分析，在相对分子质量约21 000处出现了1条新生的蛋白条带，转印NC膜后该融合蛋白可与抗TNF-α单克隆抗体特异性结合。 结论 成功构建了pd20-TNF-α基因的原核表达载体，并在大肠杆菌中进行诱导表达，为下一步融合蛋白的纯化奠定了实验基础。
[关键词] 基因融合；原核表达载体；重组融合蛋白；鉴定
[中图分类号] Q785 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）09（c）-0008-04
肿瘤坏死因子α（TNF-α）是一种多功能的细胞因子，对多种肿瘤具有明显的抑制作用，但是由于全身用药，副作用较大，限制了它的临床应用。笔者曾采用噬菌体随机肽库筛选技术，筛选到可与胃癌肝高转移潜能细胞特异性结合的线性多肽分子GRRTRSRRLRRS（pd20），实验证实pd20可与胃癌肝高转移潜能细胞特异性结合，并且裸鼠体内实验证实pd20具有胃癌肝转移的导向性，有可能作胃癌肝转移的靶向载体[1-2]，为了发挥pd20的胃癌肝转移靶向性以及减少TNF-α全身用药的毒副作用，本实验欲运用基因工程方法将pd20与TNF-α进行基因融合，以期达到靶向性治疗胃癌肝转移的作用。
1 材料与方法
1.1 材料
质粒PET28a（+）与TNF-α（人源），大肠杆菌E. coli DH5α和E.coli BL21，及各种限制性内切酶，T4DNA连接酶，质粒提取试剂盒，胶回收试剂盒均购自上海闪晶分子生物科技有限公司；蛋白分子标记（marker）购买于Fermentas公司；抗TNF-α单克隆抗体购自Santa Cruz公司；羊抗小鼠二抗和碱性磷酸酶显色试剂盒购自华美生物工程有限公司。
1.2 方法
1.2.1 pd20-TNF融合基因设计合成 胃癌肝高转移潜能细胞特异性结合肽pd20的氨基酸序列为GRRTRSRRLRRS参照Genbank上NM-000594.2序列，全基因合成法制备pd20-TNF-α基因，3"端和5"端分别引入的Nde I、Xho I酶切位点。
1.2.2 含有pd20-TNF-α基因原核表达载体的构建 将原核表达载体pet28a（+）和合成的pd20-TNF-α基因的核酸链分别用Nde I、Xho I双酶切后，经1%的琼脂糖电泳后用胶回收试剂盒回收目的片段，1%琼脂糖凝胶电泳检测结果，然后将回收的目的片段来进行连接构建表达载体。连接产物转化DH5α感受态细胞中，轻轻混匀进行冰浴，时间为30 min；后42℃热休克1.5 min，随后在冰水混合物中再次冰浴2 min，加入600 mL LB培养基中，37℃震荡培养1 h。离心5 min，收集菌体，用200 μL LB液体培养基重悬细菌后均匀涂布于LB平板（含氨苄青霉素（50 μg/mL）上，37℃温箱中培养16～18 h。挑取6个阳性菌落，分别进行PCR和双酶切鉴定。并送往上海生工生物技术有限公司进行测序，将测序结果与GenBank的Blast比对，分析其同源性。
1.2.3 pet28a- pd20-TNF-α重组质粒的PCR鉴定 挑选重组菌落培养后Triton法提取质粒DNA，并进行PCR鉴定。PCR引物为336-FCCAAATCATATGGGTCGTCGTACCCGTTCTCGT，336-R ATTTGGCTCGAGTCACAGGGCAA TGATCCCAAA。
1.2.4 pet28a- pd20-TNF-α重组质粒的酶切鉴定 将PCR鉴定正确的重组质粒用Nde I和Xho I进行双酶切鉴定。后者再经DNA序列测定，确定出序列正确的重组质粒，将其命名为Pet28a（+）-pd20-TNF-α。
1.2.5 重组蛋白的诱导表达 将鉴定正确的重组质粒克隆于LB液体培养基中，37℃振摇培养过夜约16 h，以1∶100分别接种于LB和含Kana 100 μg/mL的种子液培养基中，37℃震荡培养至OD600为0.5时，加入1 mol/L的IPTG到终浓度为1.0 mmol/L，继续培养4 h，离心法收集菌体，行SDS-PAGE。
1.2.6 SDS-PAGE及Western Blot检测 将样品进行SDS-PAGE电泳， 考马斯亮蓝染色。凝胶于转移缓冲液中平衡20～30 min。半干法转膜、丽春红染液染色，8%脱脂奶粉于室温封闭2 h；用2%脱脂奶粉稀释一抗（TNF-α单克隆抗体）4℃孵育过夜。TBST室温摇洗3次，10～15 min/次；2%脱脂奶粉稀释酶标兔抗鼠IgG为二抗，于室温孵育1～2 h，TBST摇洗3次，10～15 min/次；ECL显色。
2 结果
2.1 全基因合成法制备pd20-TNF-α基因
2.3 重组质粒酶切鉴定
PET28a（+）-pd20-TNF-α的连接产物经Nde I、Xho I双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳检测，产物中含有约750 bp的特异性条带（图2），该片段大小与理论预期结果一致，测序结果与预计基因序列比对完全一致。表明已经将目的基因成功插入PET28a（+）载体中。
2.4 融合蛋白的诱导表达
成熟蛋白阳性重组质粒表达菌，IPTG诱导培养4 h，离心收集菌体处理后，做SDS-PAGE电泳，结果表明，重组菌诱导后样品在21 kD左右有明显融合条带，结果见图3。
2.5 融合蛋白的Western blot鉴定
目的蛋白经Western-blot检测，结果显示：重组融合蛋白基因在大肠杆菌中被诱导表达后，该融合蛋白可以被TNF-α的单克隆抗体识别，在21 000处可见一结合条带，证明融合蛋白与TNF-α的单克隆抗体具有良好的结合反应（图4）。
3 讨论
胃癌患者发生肝脏转移是导致其预后差的主要原因之一，目前尚无有效的预防和治疗方法阻断胃癌肝转移的发生。由于同一类型肿瘤中不同亚系的存在，导致转移的特性不同[3-4]。如果能够找到可与具有肝转移能力胃癌细胞特异性结合的分子，从而携带抗癌药物或抑癌基因作用于这类细胞，则可有效阻断胃癌细胞肝脏转移的发生。
噬菌体随机肽库展示技术是一种筛选功能性多肽的生物学技术，其原理是以改构的噬菌体作为载体，把外源蛋白或多肽的DNA序列定向插入噬菌体外壳蛋白质结构基因区，使外源多肽或蛋白质以融合蛋白的形式表达并呈现于载体表面，进而通过高通量筛选技术，最终富集到具有特异结合性质的多肽[5]。当某种蛋白可以在细胞表面进行表达时，通过噬菌体随机肽库筛选技术就可能筛选到与这个蛋白特异性结合的多肽[6]。因此，可以利用表达已知某种蛋白的细胞进行噬菌体随机肽库的筛选，来确定这个蛋白的功能及结构特点[7]。血管内皮生长因子（VEGF）与其受体（Flt-1）结合后，可促进新生血管及肿瘤血管的生成，An等[8]以Flt-1蛋白为靶标筛选到七个特异性结合肽，其中F56（WHSDMEWWYLLG）可以作为Flt-1的拮抗肽，阻断VEGF与其受体的结合，抑制肿瘤的生长和转移。Li等[9]利用噬菌体肽库展示技术进行体内淘筛，筛选到靶向于不同肿瘤血管的多肽分子，这些多肽分子具有潜在的肿瘤血管靶向探针的作用。
笔者在前期工作中以胃癌肝高转移潜能细胞XGC9811-L为靶标，利用噬菌体随机肽库筛选技术获得的Pd20呈现噬菌体可与靶细胞特异性结合，结合后通过其外源呈现肽pd20的作用可内化入靶细胞；体外特异性检测实验发现：多肽pd20可与具有胃癌肝转移能力的细胞和组织结合，其结合力与胃癌肝脏转移能力的高低相关；且在与靶细胞（胃癌肝高转移潜能胃癌细胞XGC9811-L）结合后具有一定抑制靶细胞肝转移能力的作用[1-2]。pd20具有胃癌肝转移的导向性，如果它能携带抗癌药物或抑癌基因，可能会起到靶向性治疗胃癌肝转移的作用。
肿瘤坏死因子（TNF）是由活化的单核/巨噬细胞、NK细胞及T淋巴细胞产生的具有免疫调节及直接杀伤肿瘤细胞的多功能炎症因子，是第一个用于肿瘤生物学疗法的细胞因子[10]。随着1984年TNF-α基因的克隆，开辟了TNF临床试验的时代。许多动物实验和临床研究均表明：TNF-α对某些肿瘤包括胃癌在内具有明显的抑制作用[11-12]。由于TNF-α的最大耐受剂量很低，全身大量应用会引起严重毒副作用，因此TNF-α的临床应用目前受到限制[13]。为了提高TNF的临床治疗效果，减少药量，降低其全身毒副作用，本研究将可与胃癌肝高转移潜能细胞（XGC9811-L）特异性结合的靶分子pd20结合于TNF-α，通过靶分子pd20将TNF-α带到胃癌肝转移组织，希望起到靶向性治疗胃癌肝转移的作用。
为了进一步验证pd20的靶向性及提高TNF的选择性治疗肿瘤的作用，本研究利用基因工程方法构建了原核表达载体pet28a（+）-pd20-TNF-α，并成功地在大肠杆菌BL21中表达了融合蛋白pd20-TNF。经Western-blot分析，重组的融合蛋白能够与小鼠抗人TNF-α的mAb结合，这为下一步重组蛋白的纯化和融合蛋白的功能检测，奠定了良好的实验基础。
[参考文献]
[1] Hu Shengjuan，Guo Xinning，Fan Daiming，et al. Phage display selection of peptides that inhibit metastasis ability of gastric cancer cells with high liver-metastatic potential[J]. Biochem Biophys Res Commun，2006，341（4）：964-972.
[2] 呼圣娟，郭新宁，杨力，等.胃癌肝高转移潜能细胞噬菌体结合肽的特异性鉴定[J].现代肿瘤医学，2005，13（2）：158-160.
[3] Jennifer C. Tracing the Steps of Metastasis Cancer"s Menacing Ballet[J]. Science，2003，299：1002-1005.
[4] Robert J. Biology of cancer metastasis [J]. Bull Cancer，2013，100（4）：333-342.
[5] Pande J，Szewczyk MM，Grover AK. Phage display： concept， innovations， applications and future[J]. Biotechnol Adv，2010，28（6）：849-858.
[6] Rust S，Guillard S，Sachsenmeier K，et al. Combining phenotypic and proteomic approaches to identify membrane targets in a triple negative breast cancer cell type [J]. Mol Cancer，2013，12（1）：11.
[7] Rentero I，Heinis C. Screening of large molecule diversities by phage display [J]. Chimia（Aarau），2011，65（11）：843-845.
[8] An P，Lei H，Zhang J，et al. Suppression of tumor growth and metastasis by a VEGFR-1 antagonizing peptide identified from a phage display library [J]. Int J Cancer，2004，111（2）：165-173.
[9] Li ZJ，Cho CH. Peptides as targeting probes against tumor vasculature for diagnosis and drug delivery [J]. J Transl Med，2012，19：10.
[10] Chu WM. Tumor necrosis factor [J]. Cancer Lett，2013，328（2）：222-225.
[11] MacGill RS，Davis TA，Macko J. Local gene delivery of tumor necrosis factor alpha can impact primary tumor growth and metastases through a host-mediated response[J]. Clin Exp Metastasis，2007，24（7）：521-531.
[12] Mao W，Zhu X，Tang D，et al. TNF-α expression in the UCB-MSCs as stable source inhibits gastric cancers growth in nude mice [J]. Cancer Invest，2012，30（6）：463-472.
[13] Shaw J，Chen B，Huang WH，et al. The small-molecule TNF-alpha modulator，UTL-5g，reduces side effects induced by cisplatin and enhances the therapeutic effect of cisplatin in vivo[J]. J Exp Ther Oncol，2011，9（2）：129-137.
（收稿日期：2013-05-22 本文编辑：卫 轲）