【摘要】 钙黏蛋白（E-cadherin，E-Cad）是参与形成和维持正常细胞与细胞之间互相黏附、相互连接的一类跨膜糖蛋白，上皮细胞之间的紧密相连主要依赖E-Cad。近年研究发现，E-Cad的表达下调与恶性肿瘤的侵袭性及转移性有较大关系，其中最主要的原因是E-Cad可诱导上皮细胞发生上皮-间充质转化（EMT）。本文就E-钙黏蛋白在恶性肿瘤细胞中的表达的影响因素与上皮-间充质转化的关系研究作一综述。
【关键词】 恶性肿瘤； E-钙黏蛋白； 上皮-间充质转化
中图分类号 R730.2 文献标识码 A 文章编号 1674-6805（2014）10-0158-03
近年来，国内外众多学者研究发现，上皮间充质转化（EMT）在恶性肿瘤的发生发展过程中起到不可或缺的作用。EMT赋予了正常组织细胞迁移和侵袭的特性，从而获得类似于干细胞的潜质，使细胞正常的程序性衰老、凋亡减少，甚至导致免疫抑制。在EMT发生过程中，E-钙黏蛋白（E-Cad）的缺失被认为是最主要、最基础的因素，而直接或间接地导致E-钙黏蛋白缺失的原因有很多。本文就分析影响E-黏蛋白在恶性肿瘤细胞中的表达的各个因素与上皮-间充质转化的关系研究进展作一综述。
1 E-钙黏蛋白
E-钙黏蛋白（E-cadherin，E-Cad）编码基因定位于16号染色体择q22.1附近，是介导上皮细胞间粘连的一种细胞粘附分子，对Ca2+有高度敏感性[1]。其编码的蛋白质位于大多数上皮细胞的细胞膜上，属于抑癌蛋白。在生理条件下，E-Cad通过增加细胞间的黏附力，并抑制细胞的增殖活动来维持人体各个器官组织结构的生理形态，从而发挥其抑制癌症的功能。
目前研究认为，E-Cad基因在肿瘤组织中出现表达异常时，肿瘤细胞有很大概率的可能性从原发灶上脱落下来，即发生了肿瘤的转移行为。E-Cad基因在各种因素的影响下表达下调，与肿瘤的分化程度、是否有远处转移和局部的侵袭性、区域淋巴结的转移以及肿瘤的预后和患者的远期生存率有十分密切的关系。E-Cad基因的表达下调是由多种因素影响而导致的，这些因素包括Snail、Slug、TGF-β、Twist等转录、调控因子，还包括PI3K/AKT、Wnt、Smad、EGFR、Notch等多条信号转导通路。
2 上皮-间充质转化
上皮-间充质转化（epithelial to mesenchymal transition，EMT）是一种基本的病理生理现象，在胚胎发育、慢性炎症、多种纤维化疾病、肿瘤侵袭转移等过程中发挥了重要作用。正常状态的上皮细胞具有典型的顶面-底面极性，在人体中起保护、支持及分泌等作用。但近年来越来越多的研究发现，在多种病理的因素作用下，上皮细胞会失去细胞极性和细胞之间的黏附功能，具有类似间质细胞的形态和特性，从而获得浸润性和迁移能力，这种改变被定义为上皮间-充质转化现象。因此上皮-间充质转化是以上皮细胞极性消失，以及获得间质特性为主要特征，在形态学上发生成纤维细胞或间充质细胞的转化，并获得迁移转移的能力[2]。在上皮-间充质转化过程中，一个重要的分子事件就是E-Cad表达下调，导致细胞间的黏附功能丧失，细胞迁移能力增加。
3 影响E-钙黏蛋白表达下调因素与上皮-间充质转化的关系
3.1 E-Cad表达下调与波形蛋白（Vimentin）表达升高
在EMT发生过程中，E-Cad表达下调的同时，常伴随有多种间充质相关蛋白的升高，其中较为明显的是波形蛋白（Vimentin）的表达升高。波形蛋白表达升高会干扰E-Cad介导的细胞黏附，从而增加肿瘤细胞的迁移性。转移中的肿瘤细胞可以伸出伪足，内有许多肌动蛋白聚集成丝，这些肌丝的收缩推动了细胞的前进；同时，癌细胞分泌蛋白酶降解细胞外基质，使基底膜产生局部缺损，以允许癌细胞通过[3]。Irie等[4]的研究中提到了蛋白激酶B（AKT或PKB）在调节肿瘤细胞转移和侵袭时的功能特异性。AKT1的下游调节可增强表皮生长因子（EGF）应答刺激中的迁移，从而诱导出EMT的表型：即抑制E-Cad表达，而波形蛋白表达略有增加。相比之下，AKT2下游调节就不能加强细胞迁移或改变E-Cad的表达，但其可以减少波形蛋白的表达。
徐浩翔等[5]在综述中提到了Singh在2003年发表的一个实验：比较高侵袭性前列腺癌细胞LNCap和低侵袭性癌细胞CL1的差异蛋白时发现，LNCaP中波形蛋白的含量是CL1细胞含量的20倍，向LNCaP细胞和CL1细胞分别导入表达反义波形蛋白和正义波形蛋白的载体以改变波形蛋白的含量，结果发现原本高侵袭性LNCaP细胞的迁移数量明显减少，低侵袭性CL1细胞的波形蛋白表达水平升高但其迁移程度未明显改变，所以他们认为癌细胞中波形蛋白的高表达与细胞的侵袭性相关，波形蛋白可能通过作用于其他蛋白或者影响细胞侵袭过程较晚的阶段才能最终改变细胞的迁移能力。
3.2 转化生长因子β（TGF-β）在上皮-间充质转化中的重要作用
TGF-β为一种肿瘤抑制基因，能够抑制上皮细胞增殖、促进凋亡、刺激上皮分化、增强基因组稳定性及促进细胞衰老。因此，在许多恶性肿瘤中均可出现TGF-β信号通路组份表达下调。TGF-β可通过参与调控细胞生长、增殖、凋亡、侵袭、血管生成、免疫监视等众多关键过程诱发上皮-间充质转化，进而影响肿瘤的转移。其主要机制是TGF-β可通过Smad依赖通路从而诱发EMT的发生。另外TGF-β还可与低氧环境协同抑制E-Cad表达。TGF-β信号通路中的TGFBR是一种肿瘤抑制基因，其缺失可导致肿瘤的发生。
Vincent等[6]研究表明：典型的Smad依赖通路诱导的EMT过程如下：TGF-β首先与胞膜上的两个TGF-βⅡ型受体（TpR Ⅱ）及两个TGF-βⅠ型受体（TpR I）的复合物作用。TpR Ⅱ激活TpR I后与下游的Smad 2和Smad 3以及胞内的Smad 4结合成三聚体，进入细胞核，作用于多个转录因子如CAR、occuludin、claudin-3以及E-cad，促进EMT发生。Theys等[7]在2011年进行了E-Cad缺失与EMT在人类肿瘤细胞中联合促进放射线抗性的研究，研究者运用微阵列在缺氧条件下分析基因表达的改变，并用实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）的方法进行验证；用Western blot和免疫组化来研究暴露在低氧环境中的上皮表型转换，加入转化生长因子β（TGFβ）或肿瘤基因的激活；用克隆存活方法分析电离辐射后的细胞生存状态。实验结果发现在低氧状态、加入TGF-β或EGFR Ⅷ表达的情况下都可导致MCF7、A549和NMuMG上皮细胞出现纺锤体形，以及失去细胞之间的接触；将低氧和TGF-β或EGFR Ⅷ表达联合作用，可出现更快更显著的EMT样表现。在血管内皮生长因子（VEGF）基因表达和EMT环境中可观察到TGF-β和低氧的协同作用，且两者都是抑制E-Cad活性的重要物质。
3.3 其他因子
Snail、Zeb、E47和KLF8因子与E-Cad启动子E-box结合并抑制其表达，而Twist、Goosecoid、E2.2和FoxC2因子则是间接地抑制E-Cad转录[8]。
洪伦[9]总结文献表明，目前研究较成熟的信号通路下游有关EMT的转录因子主要有转录因子Snail、Slug、SIP1及调控因子Twist等。这类DNA结合蛋白可以通过同SIP1竞争性结合E-Cad基因启动子部位的E-box连接序列，直接下调E-Cad及上调间质来源的波形蛋白表达，从而引起EMT。Twist还能直接增强Snail的表达从而导致肿瘤发生EMT。Eduard[10]研究也表明了Snail同样也可作用于E-box而抑制E-Cad的表达，并在MDCK（狗肾传代细胞，Madin-Darby canine kidney）上皮细胞、口腔癌、肺癌A549细胞等研究中均有此发现。
3.4 信号通路，如EGFR、PI3K/AKT、Wnt、Smad及Notch通路也参与E-Cad表达下调
在转移性恶性肿瘤中，PI3K/AKT是研究得比较深入的一条重要通路。AKT是信号转导途径中重要的蛋白激酶，其中PI3K下游的靶蛋白，是PI3K/AKT信号转导通路的核心，目前大量研究表明在人类许多种类的肿瘤中可发现AKT过表达，PI3K/AKT通路的持续活化与肿瘤的发生发展密切相关。PI3K/AKT通路主要通过增加肿瘤细胞的运动能力、对生长因子受体（如IGF-IR）的调节作用、降低细胞间的黏附力、对细胞外基质的影响、增加核转录因子的活性（如活化的AKT可增加转录因子NK-κB活性，从而上调MMP-2＼MMP-9和COX-2的表达，促进癌细胞侵袭）、对转移相关的酶的磷酸化及其本身的活化具有细胞膜转位的能力等几个方面来促进恶性肿瘤转移。
Grille等[11]研究表明，人类鳞癌细胞株SCC15转染myr-AKT（激活型AKT）后丧失了鳞状上皮细胞的形态学特征，呈现了成纤维细胞样特点。Western-Blot检测亲代SCC15无弹性蛋白（间充质细胞标记）的表达。而转染v-AKT（非激活型AKT）细胞则反之。共聚焦显微镜显示SCC15的平均高度为6.0 μm，而转染了AKTc（AKT抑制基因）的SCC15细胞大约有3.8 μm。由此得出结论：激活的AKT诱导产生EMT。在转染v-AKT的细胞中β-连环蛋白和p130cas都显示为表达下降。AKT直接影响了上皮细胞的形态学特征、成瘤性、细胞运动力和侵袭力。研究数据显示，PI3K被SRC和RAS激活后激活下游AKT，再激活靶蛋白Rac和Rho（两种小G蛋白），它们与细胞骨架重构，细胞迁移和侵袭有关。AKT还能抑制E-Cad的基因的转录[12]。
Luika[13]研究观察到：N1IC可能通过snail诱导降低了血管内皮钙黏蛋白（VE-Cad）的表达。故Notch通路可在体外培养的永生化内皮细胞中诱导snail，导致EMT的发生。朱智杰等[14]总结国内外文献资料表明，Wnt信号通路可通过下调E-Cad表达从而诱导EMT。其主要机制：在没有Wnt信号时，大部分β-连接蛋白与E-Cad和细胞骨架蛋白结合形成复合物维持其稳定性，使胞质内游离的β-连接蛋白维持在低水平，不能进入核内激活作用靶点；在有Wnt信号存在时，形成Wnt蛋白、Frizzled和LRP5/6的复合物，信号通过作用于胞质内复合物，使复合物失活，并发生解离，结果导致β-连接蛋白在细胞质内积累，转位进入细胞核，诱发EMT发生。
Irie等[4]研究发现：在头颈部鳞状细胞癌肿瘤中，过度激活EGFR通路与肿瘤更强的侵袭性和不良的预后有关。EGFR通路的逐级激活反过来可导致基因的转录，这是细胞周期进行的主要原因。EGFR通路在许多人类癌症中有高表达，包括头颈部癌，导致辐射抗性和肿瘤发展。越来越多的证据表明EGFR通路可在若干种肿瘤发生EMT时调节蛋白质的表达，这个发现可用高表达E-Cad的头颈部肿瘤模型来证明，这个肿瘤模型对抗EGFR抗体西妥昔单抗高度敏感，然而一个表达波形蛋白的肿瘤品系显示出对西妥昔单抗的低度敏感性。研究者发现，尽管在高表达E-Cad和高表达EGFR片段之间有着微弱的联系，但并不是所有表达E-Cad的肿瘤细胞都会表达EGFR。人类多种恶性肿瘤中均可检测到EGFR mRNA或蛋白质过度表达，伴有或不伴有EGFR基因的扩增。EGFR的表达或与其配体的共表达也与结肠癌、乳腺癌、胰腺癌的预后不良有关。
3.5 EMT诱导物
还有一些新发现的EMT诱导物，如两个酪氨酸磷酸酶：Pez和PRL3，两者均可促进EMT发生。TGF-β可诱导Pez，且Pez的充分表达可通过Snail通路和Zeb基因在MDCK细胞中引发EMT。Pez也可诱导TGF-β生成，形成一个自分泌激活循环回路。PRL3则是通过在克隆出的癌细胞中激活PI3K/AKT来诱导EMT发生。这些通路的作用加强可增加PTEN的降解，并激活Snail1；因为在辐射诱导细胞凋亡中PTEN是Snail抑制的直接靶点，因此这些通路也可能加强抑制PTEN表达。Podoplanin黏蛋白在MDCK细胞中通过激活RhoA诱导EMT发生。尽管在体外培养的胰腺肿瘤模型的浸润前沿细胞中有E-Cad表达，但Podoplanin在此区域也依然可表达，这个现象可推延至其他高发的高度恶性肿瘤中。也许提高人类肿瘤样品的浸润前沿细胞的单个细胞分辨率，对其进行更深入的研究可明确E-Cad和Podoplanin表达的关系[8]。另外一些实验表明，在口腔癌的进展过程中，E-Cad表达下调可由遗传和表观遗传基因导致，如基因突变和启动子序列的甲基化[15]。
根据以上文献资料显示，导致E-Cad表达下调的因素有多种，其中较为重要的主要有：转录因子Snail、Slug；调控因子Twist[16]；波形蛋白[17-18]；信号通路PI3K/AKT、Wnt、TGF-β的Smad依赖通路、EGFR通路、Notch通路；基因甲基化等。各因素最终结果均可通过下调E-Cad表达，从而诱导上皮细胞发生EMT，使肿瘤细胞获得转移及侵袭能力。多项研究已经证实，在消化系统恶性肿瘤（如口腔癌、食管癌、肝癌、胰腺癌[19]、胃癌等）、呼吸系统恶性肿瘤（喉癌、鼻咽癌、肺癌等）、乳腺癌、恶性黑色素瘤[19]等处的肿瘤侵袭和转移过程中均有EMT的发生，并且其程度与肿瘤的恶性程度呈明显正相关。
4 展望
正是由于EMT的发生，在临床上治疗恶性肿瘤较为困难且难以做到靶向治疗。其原因在于细胞表型的变化以及有关信号通路及转录因子的改变与肿瘤对化疗药物的治疗反应间存在联系。随着放疗化疗的进行，多种肿瘤细胞能通过逐渐发生EMT来“逃避”治疗所致的凋亡，进而使得细胞具有更强的转移特性。另外，由于肿瘤上皮细胞发生了EMT，细胞将表达间质分化标志物，同时对靶向治疗上皮的化学治疗药物敏感性下降。因此，深入了解导致E-Cad表达下调的因素可在一定程度上有目的地针对该因素进行抑制，阻止EMT发生，或减少其发生程度，使恶性肿瘤治疗生存率提高。
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（收稿日期：2013-12-17） （编辑：韩珊珊）