【关键词】 大肠癌； 恶性肿瘤； 微转移
中图分类号 R73 文献标识码 A 文章编号 1674-6805（2013）20-0154-03
大肠癌是消化道常见的恶性肿瘤，近年来我国大肠癌发病率和病死率呈逐年上升趋势，即使接受了根治性手术的大肠癌患者中仍有40%-50%死于术后肿瘤复发与转移[1]。癌细胞经血液途径转移是大肠癌转移的重要途径之一。研究证实，血液中是否存在微转移与患者的临床预后密切相关，无血液微转移患者的生存率明显高于有微转移的患者[2]。本文就近年来大肠癌血液途径微转移检测方法的研究现状进行综述。
1 微转移概念
微转移概念是在1971年由Huvos等在乳腺癌中首次正式提出。随着现代分子生物学诊断技术如聚合酶链反应（PCR）技术的发展及标准化，通过检测基因突变来诊断基因水平的“微转移”已成为现实。目前肿瘤微转移概念标准化为：非血液系统的恶性肿瘤在发展过程中播散并存活于淋巴系统、血循环、骨髓等组织中的微小肿瘤细胞灶，可为单个瘤细胞或独立的瘤细胞病灶，直径<2 mm，无特殊血供，常无任何临床表现，具有逃脱免疫监视、侵犯血管及发展成为肉眼可见病变的能力，常规HE染色检测方法很难发现其存在[3]。
2 与血液微转移相关的的检测标志物
癌胚抗原（CEA）是一种最常见的肿瘤相关抗原，由于活性极高的核酸酶广泛存在于人体体液中，细胞外环境中不能存在游离的RNA，一旦在肿瘤患者血液中发现CEA mRNA，可以认为血液中有肿瘤细胞存在，检测血液中CEA mRNA可帮助了解与监测肿瘤血行转移[4-5]。表皮生长因子受体（EGFR）在许多人类上皮源性恶性肿瘤组织中表达增强，上皮性肿瘤中EGFR的表达或过表达成为恶性肿瘤的重要特性之一[6]。有学者用RT-PCR方法检测外周血中EGFR mRNA的表达以判断是否存在循环癌细胞，证实其对于肿瘤的判断预后及指导治疗方案的选择均具有重要意义[7]。基质金属蛋白酶（MMP）是一种Zn2+依赖性的蛋白水解酶，已发现20余种亚型，其中MMP-7具有强大的基质降解活性，它在肿瘤的发生、转移和浸润过程中起重要作用[8]。MMP-2、MMP-9也是基质金属蛋白酶家族（MMPs）的重要成员，具有破坏基质膜、促进肿瘤细胞通过血管内皮进行侵袭转移的作用。细胞角蛋白（CK）是近些年来研究肿瘤微转移较多的一种肿瘤标志物，至少包括20个成员，其中CK19与CK20被认为有肿瘤转移诊断价值。但CKl9可在正常的对照（包括外周血）中不同程度地被检出，而CK20表达范围特异，它非常局限于胃肠上皮细胞，几乎所有大肠癌都明显表达，而在其他正常组织如骨髓、淋巴结、外周血均不表达[9]，在侵袭、转移、扩散到其他组织器官时始终保持稳定，尤其适用于检测大肠癌微转移[10]。
上述肿瘤标志物已较好地应用于大肠癌血液微转移的研究中，而随着微转移研究的深入，其他一些标志物也逐渐成为研究热点。如血管内皮生长因子VEGF、凋亡抑制蛋白Livin、鸟苷酸环化酶C（GC- C）、端粒酶（TLMA）等，目前已从理论上证实这些均符合大肠癌血液微转移标志物的筛选指标。
3 大肠癌血液微转移的检测方法
3.1 免疫细胞化学法（ICC）
ICC是以显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和细胞化学的呈色反应，对相应抗原进行定位、定性和定量测定的技术。早期有学者用ICC方法对23例进展期胃、大肠癌切除患者门静脉血及外周血进行癌细胞的检测，阳性率为17.4%，血中癌细胞浓度在40～1000 个/ml范围内[11]，ICC检测血液循环中的癌细胞有助于预测肝内微转移灶的发生。ICC的主要优点是可进行形态学分析，但缺点是检测的细胞量少，在检测循环血中肿瘤细胞时，每个载玻片上所能检测的细胞样本量为5×105个细胞，而理想的检测肿瘤细胞的方法能从2.5×108个外周血有核细胞中检测出单个肿瘤细胞[12]。因而目前在循环肿瘤细胞的临床检测方面受到限制。
3.2 酶联免疫法（ELISA）
ELISA可以测定组织匀浆或血清中肿瘤抗原的水平，并以此作为确定微转移的指标。万彦彬[13]应用ELISA方法在检测200例结直肠癌患者（观察组）、60例健康成人（对照组）血清中MMP-2、MMP-9和MMP-14的含量，显示观察组血清中上述三项指标的表达量显均著高于对照组（P<0.01），推测三者可能在结直肠癌发生发展中起重要作用。另有学者采用双抗体夹心法ELISA测定52例大肠癌患者血清HGF（肝细胞生长因子）含量显著升高，合并肝转移的大肠癌患者较之无转移的大肠癌患者的HGF值更高（P<0.05），证实ELISA方法检测HGF可作为大肠癌患者有无肝转移的一个较好的判断指标[14]。
3.3 流式细胞技术（FCM）
FCM是一种集激光技术、电子物理技术、计算机技术及单克隆抗体等技术为一体的新型技术[15]。何成全等[16]应用FCM检测66例胃癌患者外周血中CK19、CK20的表达，显示CK19、CK20、CK19+CK20阳性表达率分别为53.1%、56.1%和46.9%。但由于流式细胞术检测靶细胞的敏感度仅为1/104，而外周血中肿瘤细胞的数量常少于1/106，单纯以流式细胞术检测肿瘤患者中的循环肿瘤细胞的方法尚存在争议[17]。
3.4 蛋白指纹图谱技术
蛋白指纹图谱的前期样品分离技术是由蛋白质芯片或赛尔迪磁珠来完成，可用来检测肿瘤标记蛋白指纹，特别是对CEA阴性结直肠癌患者的早期检测及健康体检有意义。有国外学者采用此方法检测CEA在结直肠癌中的阳性率为56.7%，而由3个差异峰组成的诊断模型对CEA阴性结直肠癌的阳性检测率为100%[18]。最近有国内学者用高灵敏的激光解析电离飞行时间质谱技术（SELDI -TOF-MS）检测大肠癌患者血清蛋白指纹图谱[19]，利用人工神经网络技术建立大肠癌的诊断模型和预后模型，结果显示诊断模型对大肠癌的诊断灵敏度和特异度分别为82.22%和80.45%，准确度为80.80%；预后模型对大肠癌术后复发或转移的诊断符合率为62.96%。证实其对提高大肠癌的早期诊断水平、改善大肠癌预后具有重要的潜在意义。
3.5 逆转录多聚酶链反应技术（RT-PCR）
RT-PCR技术的原理是通过扩增出肿瘤细胞标志性靶RNA来证实肿瘤细胞的存在，可准确检测1 g组织或1 ml液体中的1个癌细胞，具有高度敏感性和特异性，被认为是目前检测肿瘤微转移的最有效方法之一。宗祥云等[20]应用RT- PCR方法检测83例大肠癌患者外周血GC-C mRNA，阳性率为68.7%。但近年来已证实这种常规的RT-PCR技术敏感性还有限，有学者使用经过改良的巢式RT-PCR技术，可从1 ml全血中检出所含的1个大肠癌细胞CK20 mRNA，进一步提高了检测靶基因的敏感度，更适合临床微转移的检测[21]。李晓阳等[22]应用逆转录-套式-聚合酶链反应技术（RT-NP-PCR） 检测血液标本CEA mRNA，特异性97.8%，灵敏度68.6%，准确度83.4%。证实改良的巢式RT-PCR技术检测血中微转移的大肠癌细胞具有简便、快速、灵敏的优点，有助于癌细胞微转移的早期诊断。但RT-PCR技术检测血液中肿瘤细胞只能定性而不能定量，近来发展起来的实时荧光定量PCR检测方法能弥补这一缺陷。
3.6 实时荧光定量PCR（FQ-PCR）
实时荧光定量PCR的基本技术原理是在PCR反应过程中，随着产物的不断增加，引入染料或探针的荧光成比例的变化，同时记录相应的循环数，通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图[23]。通过样品中目的基因与内对照基因起始拷贝数的对比，得到目的基因的基因剂量，是目前检测基因的最佳方法之一。有学者应用FQ-PCR方法检测GC-C含量的线性范围为101～109 pg/ml[24]，样本批内和批间变异系数（CV）值分别为0.87%～11.12%、8.86%～15.19%，大肠癌患者外周血GC-C mRNA的检出率为83.8%，FQ-PCR检测外周血大肠癌细胞具有较好的检测灵敏度、特异性和重复性。另有学者使用FQ-PCR技术检测结直肠癌患者的外周血标本hTERT mRNA表达水平显著高于正常对照组，hTERT mRNA诊断结直肠癌的ROC曲线下面积0.91[25]，诊断界值为Ct≤32，证实FQ-PCR技术克服了传统PCR只能定性检测而不能定量检测的缺点。
4 联合检测多项标志物的应用
PCR技术经过30余年的发展，因其对肿瘤靶细胞的检测具备较高特异性及灵敏度，目前已成为肿瘤微转移研究的主要检测方法。但对单一标志物的检测结果的阳性率及敏感性尚受到一定程度的限制。近年来已有多项研究证实联合检测多项标志物能提高检测结果的阳性率、敏感度及特异性。李招云[26]应用荧光定量PCR技术检测大肠癌患者外周血中CK19 mRNA、CK20 mRNA和CEA mRNA水平，阳性率分别为50.0%、36.8%和47.4%，联合三项指标检测阳性率可达68.4%，较单项检测阳性率有明显提高。吴方[27]采用实时定量反转录聚合酶链反应检测大肠癌外周血CEA、CK20、survivin mRNA转录的阳性率分别为41.3%、47.8%、72.8%，三个肿瘤标志物转录均阳性者对诊断复发的敏感度和特异度分别为58.8%、86.2%；阳性似然比为4.26；对诊断死亡的敏感度、特异度、阳性似然比分别为61.9%、78.8%、2.91。
血液循环中肿瘤细胞微转移的出现并不意味着一定形成明显的临床病灶，但一旦条件许可（如癌细胞的生物学特性、机体的免疫状态及宿主器官微环境等），即能进入增殖状态而发展为临床显性转移。因此，在肿瘤细胞微转移阶段即采取针对性、个体化的临床干预措施，就能获得对肿瘤治疗更满意的临床疗效，而在肿瘤微转移阶段寻找一种灵敏度更高、特异性更强的检测方法尤为重要。目前，血液微转移的检测方法有待统一，检测结果有待标准化，其对大肠癌患者治疗及预后的临床意义尚有待进一步研究。随着现代生物分子检测技术的不断发展及对大肠癌微转移研究的不断深入，大肠癌血液微转移检测将在大肠癌的临床诊断和治疗中发挥更大作用。
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（编辑：王春芸）