[摘要] 目的 探讨TB-IGRA联合其他几种检测方法在结核筛查中的应用效果。 方法 选择2017年1～8月我院门诊收治的795例患者，根据病情分为结核组和非结核组，均行痰涂片、痰培养、PPD皮试、γ-干扰素释放酶联免疫法（TB-IGRA）、结核分枝杆菌IgG/IgM抗体检测。统计并分析痰涂片、痰菌培养、PPD试验、TB-IGRA、IgG/IgM的开展情况、灵敏度、特异性、约登指数;分析TB-IGRA检测的特异性和灵敏度;比较TB-IGRA检测分别与PPD试验、IgG/IgM抗体并、串联检测的特异性和灵敏度。 结果 痰菌培养、TB-IGRA检测的开展数量最多，PPD试验开展数量最少（P<0.05），以临床判定结果为金标准，行灵敏度、特异性、约登指数比较，痰菌阳性检出率最低，仅检出5例。痰涂片、痰菌培养的灵敏度低于PPD试验，但特异度高于PPD试验，TB-IGRA检测和IgG/IgM抗体检测的灵敏度高于PPD试验（P<0.05），选择灰区范围在8.32～19.10之间的样本46例，统计分析得到TB-IGRA检测灰区范围内样本的灵敏度、特异性分为23.08%、54.55%。TB-IGRA分别与PPD试验或IgG/IgM抗體检测行并、串联分析，可显著提高检查结果的灵敏度。 结论 TB-IGRA检测方法用于区域性结核筛查，灵敏度和特异性高。对于灰区样本，联合PPD试验、IgG/IgM抗体检测有助于提高检测灵敏度。
[关键词] 结核病;结核筛查;灰区;γ-干扰素释放实验
[中图分类号] R52 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2018）36-0085-04
[Abstract] Objective To explore the application effect of TB-IGRA combined with other detection methods in tuberculosis screening. Methods 795 patients admitted in our hospital from January to August 2017 were divided into tuberculosis group and non-tuberculosis group according to the condition. All patients were treated with sputum smear， sputum culture， PPD skin test and γ-interferon release enzyme immunoassay（TB-IGRA）， M. tuberculosis IgG/IgM antibody detection. The development situation of sputum smear， sputum culture， PPD test， TB-IGRA and IgG/IgM， sensitivity， specificity， Yoden index was statistically analyzed. The specificity and sensitivity of the PPD assay was analyzed. The specificity and sensitivity of the TB-IGRA assay， PPD assay， IgG/IgM antibody in parallel detection and tandem detection were compared. Results The development number of sputum culture and TB-IGRA test was the highest， and the number of PPD test was the lowest（P<0.05）. The clinical judgment results were the gold standard and the sensitivity， specificity， and Yoden index were compared. The detection rate of sputum-positive was the lowest， and only 5 cases were detected. The sensitivity of sputum smear and sputum culture was lower than that of PPD test， but the specificity of sputum smear and sputum culture was higher than that of PPD test. The sensitivity of TB-IGRA test and IgG/IgM antibody detection was higher than that of PPD test （P<0.05）. 46 cases of gray area range from 8.32. to 19.10 were selected. Statistical analysis showed that the sensitivity and specificity of samples in the gray area of TB-IGRA detection were 23.08% and 54.55%. TB-IGRA could be combined with PPD test or IgG/IgM antibody detection in parallel detection and tandem detection， which significantly improved the sensitivity of the test results. Conclusion The sensitivity and specificity of TB-IGRA assay used for regional tuberculosis screening is high. For gray area samples， combined PPD test and IgG/IgM antibody detection help to improve detection sensitivity.
[Key words] Tuberculosis;Tuberculosis screening;Gray area;γ-interferon release experiment
世界卫生组织发布的《2017全球结核病报告》中指出，结核病为全球第九大致死疾病。2016年，全球约有1040万例患结核病[1]。中国是结核病疫情较为严重的国家之一，近年来，随着全国范围内结核防治规划的实施，结核疫情有所缓解，但耐药患者和无症状肺结核比例明显增加，因此，临床需要寻找一种快速准确的方法检测结核分枝杆菌感染，以便更好的防治结核病[2]。目前，临床诊断主要以细菌学检查结果为判定依据，结合患者的临床症状和各项生命体征，以及胸部影像学检查结果行综合分析。但细菌学诊断缺点在于操作复杂、检测周期长、阳性检出率低[3]。近年来，随着免疫学及分子生物学技术的发展，结核诊断的方法选择增多。我国常用的潜伏性结核感染（latent tuberculous infection，LTBI）诊断技术包括结核菌素纯蛋白衍生物（purfied protein derivatives tuberculin，PPD）试验、γ-干扰素释放试验（interferon gamma release assay，IGRA）[4]。目前国内生产的酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，Elisa）结核检测试剂盒，均以“阴性”和“阳性”来报告结果。然而“阳性判断值”（cut-off值）的设置不能区分所有的结核和非结核样本，特别是在cut-off值附近的样本，因此在cut-off值附近存在一个“灰区”[5]。通过受试者工作特征曲线（ROC曲线）确定TB-IGRA结核检测试剂盒的灰区，可指导临床结果判读[6-7]。为了探讨TB-IGRA及其他几种检测方法在结核筛查中的应用效果，本研究特选取了我院门诊收治的795例患者，通过多种方法联合检测，分析统计结果，帮助区域性结核筛查方案确立。现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选择2017年1～8月我院门诊收治的795例患者，患者主要来源于外科、呼吸科、肿瘤科等，所有患者的病情均有明确临床诊断结果。本研究符合人体试验伦理学标准，获得嘉兴市第一医院伦理委员会的批准，受试者充分了解研究内容并签署知情同意书。患者男470例，女325例，年龄18～101岁，平均（52.4±2.6）岁。其中结核病患者216例，男118例，女98例，年龄18～101岁，平均（52.7±2.3）岁。非结核患者579例，男352例，女227例，年龄18～93岁，平均（52.6±2.5）岁。比较结核病和非结核病患者的性别、年龄等一般资料，差异无统计学意义（P>0.05）。
1.2 研究方法
1.2.1 试剂和仪器 结核分枝杆菌相关γ-干扰素检测试剂盒购自北京万泰公司，结核分枝杆菌IgG/IgM抗体检测试剂盒购自北京健乃喜生物技术有限公司，RT-6100酶标分析仪和RT-3100全自动洗板机购自深圳雷杜生命科学股份有限公司，电热恒温培养箱购自上海一恒科学仪器有限公司等。
1.2.2 痰涂片及痰菌培养 参照《肺结核诊断标准（WS288—2017）》进行检测[8]。阳性（+）：涂片显微镜检查阳性;分枝杆菌培养阳性，菌种鉴定为结核分枝杆菌复合群。
1.2.3 PPD皮试 由医院医务工作人员进行操作，皮下注射PPD 0.1 mL，72 h后检测，记录结果。阴性（-）：硬结平均直径<5 mm或无反应者为阴性。阳性（+）：硬结平均直径≥5 mm者为阳性。
1.2.4 TB-IGRA检测 样本类型为肝素锂抗凝新鲜全血，样本采集、处理及检测过程参照试剂盒说明书，操作严格按说明书进行，记录结果。阴性（-）：N≤400、P-N≥20、T-N<14或<N/4。阳性（+）：N≤400、、P-N为任何值、T-N≥14或≥N/4。
1.2.5 IgG/IgM检测 样本类型为抗凝全血、血清或血浆，样本采集、处理及检测过程参照试剂盒说明书，操作严格按说明书进行，记录结果。阴性（-）：仅出现一条质控线C。阳性（+）：在质控线C出现的前提下，如果只有 T1 反应线出现为抗结核 IgM 抗体阳性，只有 T2反应线出现，为抗结核 IgG 抗体阳性，T1、T2 反应线均出现，为抗结核IgG/IgM 抗体都为阳性。
1.2.6 TB-IGRA检测与PPD试验及IgG/IgM检测串并联分析 串联检测即分别进行TB-IGRA检测和PDD试验（或IgG/IgM检测），两项检测结果均为阳性时判定为阳性;并联检测即分别进行TB-IGRA检测和PDD试验（或IgG/IgM检测），两项检测结果中任意一项为阳性时判定为阳性。
1.3 观察指标
统计并分析痰涂片、痰菌培养、PPD试验、TB-IGRA、IgG/IgM的开展情况、灵敏度、特异性、约登指数;分析TB-IGRA检测的特异性和灵敏度;比较TB-IGRA检测分别与PPD试验、IgG/IgM抗体检测的特异性和灵敏度。
1.4 统计学方法
采用SPSS 22.0统计软件进行数据处理分析，计量资料以（x±s）表示，采用t检验，计数资料以[n（%）] 表示，采用χ2检验，P<0.05表示差异有统计学意义。统计TB-IGRA检测结果，绘制ROC曲线，根据线性内插法公式：，找出方法理论灰区范围，统计并分析灰区范围内样本检测结果。
2 结果
2.1 各项检测的样本数量比较
痰菌培养、TB-IGRA检测的开展数量最多，PPD试验开展數量最少，差异具统计学意义（P<0.05）。见表1。
2.2 各项检测方法的灵敏度、特异性、约登指数比较
以临床判定结果为金标准，行灵敏度、特异性、约登指数比较，痰菌阳性检出率最低，仅检出5例。痰涂片、痰菌培养的灵敏度低于PPD试验，但特异度高于PPD试验，TB-IGRA检测和IgG/IgM抗体检测的灵敏度高于PPD试验，差异具统计学意义（P<0.05）。见表2。
2.3 TB-IGRA檢测结果
2.3.1 ROC曲线分析 根据TB-IGRA检测值（T-N）及临床诊断的结果，用SPSS绘制ROC曲线。
2.3.2 灰区分析 根据ROC曲线，依据曲线走势，设定TB-IGRA的假阳性率为25%，根据线性内插法公式[9]，计算其灰区上限值为19.10;若设定TB-IGRA的假阴性率为10%，根据线性内插法公式，计算其灰区下限值是8.32。
2.3.3 灰区范围样本数据分析 选择灰区范围在8.32～19.10之间的样本46例，统计分析得到TB-IGRA检测灰区范围内样本的灵敏度、特异性分为23.08%、54.55%。
2.4 TB-IGRA检测与PPD试验及IgG/IgM检测串并联分析
选择同时进行PPD试验及TB-IGRA检测的样本84例，其中37例为结核样本，47例为非结核样本;同时行TB-IGRA检测及IgG/IgM抗体检测样本513例，其中133例为结核样本，380例为非结核样本。将TB-IGRA检测结果分别与PPD试验、IgG/IgM抗体检测结果进行串并联分析，可显著提高检查结果的灵敏度。
3 讨论
近年来，实验室方法开始在结核病诊断、疗效评价和化疗方案的制定中起重要辅助作用，受到临床重视。目前，结核病的实验室诊断方法发展迅速，临床上主要采用痰结核 DNA 扩增、痰涂查抗酸杆菌、结核杆菌培养等[10]。TB-IGRA 作为一种新的结核病辅助诊断方法已经开始在临床使用。
TB-IGRA的抗原体系来自1996年Mallairas等发现的通常只存在于致病性结核分枝杆菌中的一段名为“RDl”基因序列[11-12]。目前，该RDl序列仅存在于极少数的非结核杆菌，编码的蛋白（ESAT-6蛋白质和CFP-10蛋白质）仅存于致病性结核杆菌。TB-IGRA是基于人新鲜外周血中结核分枝杆菌特异性T细胞免疫反应，通过酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清中γ-干扰素的含量。检测结果不受卡介苗接种和环境分枝杆菌干扰[13]，检测周期短，临床应用方便。然而这种方法本身具有局限性，存在不确定结果及和临床诊断不一致的情况。
本研究为了探讨TB-IGRA联合其他几种检测方法在结核筛查中的应用效果，统计并分析结果，痰菌培养、TB-IGRA检测的开展数量最多，PPD试验开展数量最少（P<0.05）， 以临床判定结果为金标准，行灵敏度、特异性、约登指数比较，痰菌阳性检出率最低，仅检出5例。痰涂片、痰菌培养的灵敏度低于PPD试验，但特异度高于PPD试验，TB-IGRA检测和IgG/IgM抗体检测的灵敏度高于PPD试验（P<0.05），TB-IGRA检测灵敏度为85.58%，约登指数为0.59，是目前结核感染最敏感及可靠的检测方法之一[14]。选择灰区范围位于8.32～19.10之间的样本46例，统计分析得到TB-IGRA检测灰区范围内样本的灵敏度、特异性分为23.08%、54.55%。样本保存情况、操作情况、环境温度等均可能对ELISA检测结果造成一定影响[15]。对处于cut-off附近的样本统计分析，TB-IGRA检测灵敏度、特异性均大幅下降[16]。在标准化操作下，通过灰区范围设置，可以防止临界阴阳性样本误诊，有助于提高临床诊断效率。对TB-IGRA检测分别与PPD试验、IgG/IgM抗体检测进行串并联分析，发现两种方法并联检测能提高一部分灵敏度。进行特异性统计时，发现两种方法串联检测，可显著性提高特异性，这可以弥补TB-IGRA在结核检测时的过诊情况。
痰涂片、痰菌培养是一项较为简单的微生物形态学检验技术，价格便宜，操作快速、简便特异性强，目前是基层医院初筛及诊断结核病的主要检测手段，但该方法灵敏度太低，特别是用于筛查潜伏性结核意义不大[17-18]。IgG/IgM的阳性检出率与患者的疾病程度及免疫状态密切相关。患者病程越长，病变程度越严重、免疫水平越高，免疫应答越强，IgG、IgM等免疫球蛋白越多，阳性率较高，反之阳性率较低[19]。在进行区域性结核筛查过程中，因PPD试验需要二次回访，可能不适用结核筛查，TB-IGRA的诊断价值优于PPD试验及IgG/IgM抗体检测，对菌阴肺结核具有辅助诊断价值[20]。对于处在cut-off值附近的结果，可通过灰区范围设置，联合PPD试验或IgG/IgM抗体检测来提高这部分样本的检测准确度。
综上所述，TB-IGRA检测方法用于区域性结核筛查，灵敏度和特异性高。对于灰区样本，联合PPD试验、IgG/IgM抗体检测有助于提高检测的准确度。
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（收稿日期：2018-09-12）