[摘要] 目的 检测食管鳞癌中T淋巴瘤侵袭转移诱导基因1（Tiam1）和血管内皮生长因子（VEGF）的表达特点，关注其对CD31标记的血管生成的作用。 方法 以87例食管鳞癌标本作为观察组，72例正常食管黏膜组织作为对照组，采用流式细胞技术，分别检测二组中Tiam1、VEGF和CD31的表达，探讨其在不同临床特征中的表达差别及相关性。 结果 Tiam1、VEGF和CD31蛋白在食管鳞癌中高表达，Tiam1、VEGF和CD31的表达与食管癌的浸润深度、分化程度、淋巴结转移及PCNA的增殖指数密切相关；线性相关性分析显示Tiam1、VEGF和CD31的表达之间均呈正相关性。 结论 Tiam1、VEGF和CD31在食管鳞癌中高表达，二者对肿瘤进展有重要作用，Tiam1和VEGF可能对促进CD31标记的新生血管内皮细胞的增殖有一定作用，联合检测Tiam1、VEGF和CD31蛋白可能与预后有关。
[关键词] 食管鳞癌；T淋巴瘤侵袭转移诱导基因1；血管内皮生长因子；CD31；流式细胞技术
[中图分类号] R735.1 [文献标识码] C [文章编号] 1673-7210（2012）08（b）-0095-02
The study of expression of Tiam1, VEGF and CD31 in esophageal squamous cell carcinoma and their correlations of them
WANG QichuanWANG QingWAN LixinQU ZhongyuSHENG Jing
Department of Oncology Medical, the Central Hospital of Nanyang City, He′nan Province, Nanyang473009, China
[Abstract] Objective To detect the expression characteristics of Tiam1 and VEGF in esophageal squamous cell carcinoma, and pay close attention to angiogenesis role with markers of CD31. Methods 87 cases with esophageal squamous cell carcinoma were served as observation group. 72 cases with normal esophageal mucosa were served as control group. The expressions of Tiam1, VEGF and CD31 were detected by FCM in the two groups. Their expressive relationship and different pathological characters were analyzed in the esophageal squamous cell carcinoma. Results The expression of Tiam1, VEGF and CD31 were higher in the neoplasm groups than in control group. Their expressions were correlated with invasion, differentiation, metastasis and PCNA expressions. Positive correlation were found between Tiam1, VEGF and CD31 in neoplasm by liner relationship analysis. Conclusion The higher expressions of Tiam1, VEGF and CD31 in esophageal squamous cell carcinama has the important role in tumor progression, and Tiam 1 and VEGF can promote the angiogenesis which expresses CD31 protein. The combined detection of Tiam1, VEGF and CD31 can judge the prognosis of esophageal squamous cell carcinoma.
[Key words] Esophageal squamous cell carcinoma; Tiam1; VEGF; CD31; FCM
食管鳞癌临床常见，多数预后不良，由于其是富于血管的肿瘤，因此其血管生成在肿瘤生长和侵袭中具有重要作用。血管内皮生长因子（VEGF）是血管内皮细胞的特异有丝分裂原，可以促进血管内皮细胞的增殖，促进新生血管的生成，加速肿瘤生长及转移[1]。食管鳞癌是富于血管的肿瘤，其发生发展时肿瘤细胞中VEGF的表达升高。CD31作为血管内皮的重要标志物，对新生血管内皮细胞标记的特异性强，可以有效地反应血管新生的程度。T淋巴瘤侵袭转移诱导基因1（Tiam1）是一种鸟苷酸转换因子，特异的激活与Rac相关的通路，改变肿瘤细胞形态和功能，诱导肿瘤的生长、侵袭和转移[2-3]。本研究采用流式细胞技术，检测食管鳞癌及正常食管黏膜组织中Tiam1、VEGF和CD31的表达特点，探讨Tiam1、VEGF和CD31的关系，旨在为探讨肿瘤的生物学行为提供理论支持。
1 材料与方法
1.1 一般资料
收集2010年1月～2011年12月食管鳞癌手术后预留的新鲜标本作为观察组，标本术后立即取材，置于-80℃冰箱中冻存待检。纳入均符合WHO关于食管鳞癌的诊断标准，并经病理主治医师确诊。本组患者术前均未进行任何放化疗。本组共观察87例，年龄39～78岁，平均57.7岁，其中男47例，女40例。同时选取距肿瘤边缘5 cm外的正常食管黏膜组织标本72例作为对照组，取材及保存方法同上，本组中男40例，女32例，年龄40～78岁，平均56.9岁，两组在性别、年龄等相关因素的比较上差异无统计学意义（P > 0.05），具有可比性。
1.2 主要试剂及流式细胞检测方法
Tiam1、VEGF和CD31抗体的浓缩液均购自Santa Cruz公司。依不同稀释比例进行预实验，选取最佳染色的比例进行实验。将冻存样本取出，放在75%的酒精中固定24 h后，取出组织放在不锈钢网上，用剪子搓碎后过滤，制备成单细胞悬液。取1 mL加入稀释后的蛋白，严格按实验要求的时间和顺序加入一抗和二抗，经铜网过滤后应用流式细胞仪进行[4]。流式细胞仪依据所适应的条件调整相应参数，用系统自带的软件进行荧光的半定量分析。
1.3 结果判断标准
采用荧光指数（FI）表示Tiam1、VEGF和CD31蛋白的表达量。FI值计算公式为：
FI=
■
1.4 统计学方法
实验数据经Excel表格整理，应用SAS 6.12统计软件进行相关性检验，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，比较采用t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 Tiam1、VEGF和CD31在观察组与对照组中的表达
Tiam1、VEGF和CD31在观察组中的表达量明显高于对照组（P < 0.05），见表1。
表1观察组与对照组中Tiam1、VEGF和CD31蛋白表达的比较（x±s）
注：与对照组比较，*P < 0.05
2.2 Tiam1、VEGF和CD31在观察组不同临床特征中表达的比较
Tiam1、VEGF和CD31的表达与食管癌的浸润深度、分化程度、淋巴结转移及PCNA的增殖指数密切相关，见表2。
表2Tiam1、VEGF和CD31在观察组不同临床特征中表达的比较（x±s）
2.3 Tiam1、VEGF和CD31在食管鳞癌中表达的关系
经Spearman等级线性相关性分析显示，观察组中Tiam1和VEGF（r = 0.45，P = 0.013 5）、Tiam1和CD31（r = 0.41，P = 0.036 4）、VEGF和CD31（r = 0.46，P = 0.010 8）的表达均具有正相关性。
3 讨论
食管鳞癌是实体肿瘤，其生长和转移均依赖于新生血管的形成。血管内皮生长因子的发现及应用推动了肿瘤血管生成的研究[5]。食管鳞癌是一种富含血管的恶性肿瘤，血管生成机制复杂，并涉及到多种基因和蛋白的作用[6]。CD31是特异性的血管内皮细胞标志物，能很好地标记肿瘤发生发展过程中形成的新生血管。Tiam1作为Rho蛋白家族重要成员，是Rac1的特异性鸟苷酸转换因子，能够催化底物分子中GDP/GTP转换，促进GDP的释放以及与GTP的结合，进而激活Rac1，调节细胞骨架结构重组，促进细胞运动和迁移，参与基因表达调控、细胞增殖与凋亡。其次，Tiaml还可以介导蛋白复合物的形成以及Tiaml蛋白的细胞膜的定位，诱导膜皱褶形成，促进肿瘤的运动功能。再次，Tiaml对Racl蛋白起到明显的活化作用，并对此通路具有正向调节的功能[7-8]。
流式细胞术检测客观性强，能准确地反应蛋白的表达程度。基于此，本实验通过流式细胞术半定量检测食管鳞癌中Tiam1、VEGF和CD31的表达特点，结果显示食管鳞癌中Tiam1、VEGF和CD31高表达，提示三者在肿瘤的发生中具有重要的促进作用；实验显示肿瘤中Tiam1、VEGF和CD31的表达均呈正相关，即Tiam1、VEGF和CD31可能具有正向协同作用。Tiam1可能通过Rac通路促进VEGF的高表达，进而促进CD31阳性血管内皮细胞的高表达，形成肿瘤性的新生血管。Tiam1也可能作为上游基因，直接调节VEGF的表达，促进血管内皮细胞的形成。Tiam1在诱导VEGF表达时增加，能明显增加肿瘤间质毛细血管壁的通透性，起到双重调节血管活性的作用。也有研究显示，当Tiam1引起VEGF的激活后，通过与细胞膜上特异性受体结合而发挥多种生物学效应，特异性地促进内皮细胞分裂增殖，改变内皮细胞的基因表达方式，增加微血管的新生[9-10]。本实验结果显示食管鳞癌中Tiam1、VEGF和CD31的表达与肿瘤的浸润深度、淋巴结转移、分化程度及PCNA的表达密切相关，由于肿瘤的浸润深度、淋巴结转移、分化程度及PCNA均与患者的预后及指导治疗相关，因此提示联合检测三种蛋白的表达可能对判断预后有一定价值。
总之，Tiam1、VEGF和CD31蛋白的高表达对食管鳞癌的进展有重要的促进作用，Tiam1可能通过诱导VEGF高表达促进CD31阳性的血管内皮细胞新生，进而促进肿瘤的进展。联合检测Tiam1、VEGF和CD31的表达可能与患者的预后相关。
[参考文献]
[1] 刘爱东.流式细胞术检测胃癌中血管内皮生长因子的表达及意义[J].中国中医药资讯，2011，3（5）：219.
[2] Yang W，Lv S，Liu X，et al. Up-regulation of Tiam1 and Rac1 correlates with poor prognosis in hepatocellular carcinoma [J]. Jpn J Clin Oncol，2010，40（11）：1053-1059.
[3] Qi Y，Huang B，Yu L，et al. Prognostic value of Tiam1 and Rac1 overexpression in nasopharyngeal carcinoma [J]. ORL J Otorhinolaryngol Relat Spec，2009，71（3）：163-171.
[4] 刘爱东，庞久玲，刘士生.胃癌中基质金属蛋白酶-9和CD105表达关系的研究[J].中国老年学杂志，2009，29（4）：886-887.
[5] 庞久玲，刘爱东，张文江，等.CD34在大肠癌中的表达及意义[J].承德医学院学报，2006，23（4）：339-341.
[6] 朱宏，施瑞华，凌亭生，等.COX-2、VEGF蛋白在食管鳞癌发展过程中的表达变化及其与血管生成的关系[J].中华消化内镜杂志，2005，22（3）：179-181.
（收稿日期：2012-03-26 本文编辑：卫 轲）